يتم تقديم طريقة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة لقياس نسبة الخلايا السكانية الجانبية في خطوط خلايا الورم الصلبة.
الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي سبب مهم لنمو الورم، والانبثاث، وتكرار. عزل وتحديد CSCs ذات أهمية كبيرة لأبحاث الأورام. حاليا، وتستخدم عدة تقنيات لتحديد وتنقية CSCs من الأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية. فصل وتحليل خلايا السكان الجانبية (SP) هما من الطرق الشائعة الاستخدام. تعتمد الأساليب على قدرة CSCs على طرد الأصباغ الفلورية بسرعة ، مثل Hoechst 33342. ويرتبط efflux من الصبغة مع ناقلات كاسيت ATP ملزمة (ABC) ويمكن أن تمنعها مثبطات الناقل ABC. يتم وصف طرق تلطيخ الخلايا السرطانية المستزرعة مع Hoechst 33342 وتحليل نسبة خلايا SP الخاصة بهم عن طريق قياس التدفق الخلوي. هذا المقايسة مريحة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة. يمكن أن تساهم البيانات التي تم إنشاؤها في هذا الفحص في فهم أفضل لتأثير الجينات أو الإشارات الأخرى خارج الخلية وداخل الخلايا على خصائص الجذعية للخلايا السرطانية.
الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعات فرعية من الخلايا ذات القدرة على التجديد الذاتي وإمكانات التمايز المتعددة ، والتي تلعب دورا حيويا في نمو الورم ، والانبثاث ، وتكرار1،2. حاليا، تم تحديد CSCs أن تكون موجودة في مجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة، بما في ذلك الرئة والدماغ والبنكرياس والبروستاتا والثدي وسرطان الكبد3و4و5و6و7و8و9. ويستند تحديد CSCs في هذه الأورام أساسا على وجود البروتينات علامة السطح، مثل التعبير عالية و / أو منخفضة من CD44، CD24، CD133، وSca-19،10،ولكن لم يتم الإبلاغ عن علامة فريدة من نوعها التي يمكن أن تميز CSCs من غير CSCs حتى الآن. حاليا، يتم استخدام العديد من التقنيات لتحديد وتنقية CSCs في الأنسجة السرطانية أو خطوط الخلايا السرطانية. تم تصميم هذه التقنيات استنادا إلى خصائص محددة من CSCs. من بينها، المقايسات وفرز الخلايا الجانبية (SP) هي اثنين من الطرق الشائعة الاستخدام.
تم اكتشاف خلايا SP في الأصل من قبل Goodell وآخرون.11، عندما وصفت الخلايا الجذعية الدموية في خلايا نخاع العظم الماوس. عندما وصفت خلايا نخاع العظم الماوس مع صبغة الفلورسنت Hoechst 33342، ظهرت مجموعة صغيرة من الخلايا Hoechst 33342 ملطخة بشكل خافت في مؤامرة نقطة ثنائية الأبعاد من فحص قياس التدفق الخلوي. Hoechst 33342 هو صبغة الحمض النووي ملزمة ولها ما لا يقل عن وضعين ملزمة التي تؤدي إلى خصائص طيفية مختلفة. عند عرض انبعاث الفلورسينس على طولين موجيين في نفس الوقت ، يمكن الكشف عن مجموعات سكانية متعددة12. في المقايسة، كان متحمس Hoechst 33342 في 350 نانومتر، وقاست مضان باستخدام 450/20 نانومتر تمرير النطاق (BP) مرشح و675 نانومتر حافة مرشح تمريرة طويلة (EFLP)11. بالمقارنة مع مجموعة كاملة من خلايا نخاع العظام، تم إثراء هذه المجموعة من الخلايا مع الخلايا الجذعية الدموية تسمى خلايا SP11. خلايا SP قادرة على طرد Hoechst 33342 بسرعة. ويرتبط efflux من هذه الصبغة إلى ATP ملزمة كاسيت (ABC) الناقلات13, والتي يمكن أن تمنع من قبل بعض وكلاء مثل Fumitremorgin C14, فيراباميل وReserpine15,16. بعد ذلك ، تم الكشف عن نسب مختلفة من خلايا SP في مجموعة متنوعة من الأنسجة والأعضاء والأنسجة السرطانية وخطوط الخلايا السرطانية17و18و19. هذه الخلايا SP لها العديد من خصائص الخلايا الجذعية17،19.
تصف هذه المخطوطة هويشست 33342 وسم وتلطيخ الخلايا السرطانية المستزرعة وتحليل خلايا SP حسب قياس التدفق الخلوي. وعلاوة على ذلك، يتم عرض الأمثل للتركيز Hoechst 33342 واختيار مانع السليم لخط خلية ورم محددة باستخدام هذا النهج. وأخيرا، يتم إثبات آثار تعزيز الجذعية أو إشارات التثبيط على نسبة SP في الخلايا السرطانية. وتبين الأمثلة التجريبية أنه يمكن استخدام تحليل SP لاستكشاف آثار إشارات مختلفة، مثل التعبير الجيني، ومثبطات صغيرة، والمفعلات، والسيتوكينات، وchemkines، على جذع الورم. بالمقارنة مع الطرق الأخرى لعزل وتنقية CSCs ، مثل فرز CD44+/ CD24– السكان ، وتحليل ألدهيد ديهيدروجيناز (ALDH) ، وأجهزة قياس تكوين مجال الورم ، فإن هذه الطريقة أسهل للتلاعب وفعالة من حيث التكلفة.
هناك العديد من النقاط الرئيسية التي يجب وضعها في الاعتبار لإجراء فحص SP. الأول هو اختيار مانع مناسب، مثل فيراباميل أو ريسربين، لكل خط خلية، لأنه يتم تحديد موقع “بوابة” من خلايا SP وفقا للموضع الذي يختفي فيه عدد كبير من خلايا SP بعد إضافة مانع. لخط الخلية MDA-MB-231، Reserpine يعمل بشكل جيد. ومع ذلك، بالن?…
The authors have nothing to disclose.
وقد مولت هذا العمل مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية 81572599 81773124 81972787؛ مؤسسة العلوم الطبيعية لمدينة تيانجين (الصين) 19JCYBJC27300؛ مستشفى تيانجين الشعبي وجامعة نانكاي منحة البحوث التعاونية 2016rmnk005; صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية، جامعة نانكاي 63191153.
6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |