Этот протокол описывает шаги, предпринятые для индуцирования KRAS опухолей легких у мышей, а также количественной оценки сформированных опухолей с помощью ультразвуковой визуализации. Небольшие опухоли визуализированы в ранних точках времени как B-линии. В более поздние временные точки, относительные измерения объема опухоли достигаются с помощью инструмента измерения в ультразвуковом программном обеспечении.
С 1,6 миллиона жертв в год, рак легких вносит огромный вклад в мировое бремя рака. Рак легких частично обусловлен генетическими изменениями в онкогенах, таких как онкоген KRAS, который составляет 25% случаев рака легких. Трудность в терапевтической ориентации KRAS-управляемый рак легких отчасти проистекает из бедных моделей, которые могут имитировать прогрессирование болезни в лаборатории. Мы описываем метод, который позволяет относительную количественную оценку первичных опухолей легких KRAS в Cre-индуцируемой модели мыши LSL-KRAS G12D с помощью ультразвуковой визуализации. Этот метод опирается на яркость (B)-режим приобретения легких паренхимы. Опухоли, которые первоначально формируются в этой модели, визуализироваться как B-линии и могут быть количественно путем подсчета количества B-линий, присутствующих в приобретенных изображений. Они будут представлять относительное число опухолей, образовавшихся на поверхности мышиного легкого. Как сформированные опухоли развиваются со временем, они воспринимаются как глубокие расщелины в легких parenchyma. Поскольку окружность сформированной опухоли четко определена, вычисление относительного объема опухоли достигается путем измерения длины и ширины опухоли и применения их в формуле, используемой для измерений калибровки опухоли. Ультразвуковая томография является неинвазивным, быстрым и удобным методом, который часто используется для количественных изображений опухолей у мышей. Хотя артефакты могут появляться при получении ультразвуковых изображений, было показано, что этот метод визуализации является более выгодным для количественных показаний опухолей у мышей по сравнению с другими методами визуализации, такими как компьютерная томография (КТ) изображений и биолюминесценционной томографии (BLI). Исследователи могут исследовать новые терапевтические цели, используя этот метод, сравнивая инициацию опухоли легких и прогрессирование между различными группами мышей.
В качестве основной причины смерти, связанных с раком во всем мире, рак легких остается огнеупорным для лечения, в основном из-за отсутствия соответствующих доклинических моделей, которые могут резюмировать болезнь в лаборатории1. Около 25% случаев рака легких связаны с мутациями в онкогене KRAS2. РАК легких, управляемый KRAS, часто ассоциируется с плохим прогнозом и низкой реакцией на терапию, подчеркивая важность дальнейших исследований в этом заболевании2.
Мы оптимизировали метод, который позволяет относительную оценку роста опухоли легких в режиме реального времени у раков легких, вызванных иммунными компетентами. Мы используем мышей Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D), в которых онкоген KRAS G12D может быть выражен криовирусными векторами3,4. Эти переносчики обусловлены углеродной ангидразой 2, что позволяет вирусной инфекции происходит именно в альвеолярных эпителиальных клеток5. Кроме того, для ускорения инициации и прогрессирования опухолей легких, лентивирусная конструкция также выражает P53 shRNA от промоутера U6/H1 (лентивирусная конструкция здесь будет называться Ca2Cre-shp53)6. Биологическая значимость этого метода заключается в естественном течении развития опухолей легких у мышей, в отличие от ксенотрансвтатов неортогадляических опухолей у мышей. Препятствием с помощью ортотопического метода является мониторинг роста опухоли легких без ущерба для мыши. Чтобы преодолеть это ограничение, мы оптимизировали ультразвуковую визуализацию, чтобы позволить анализировать прогрессирование опухоли легких в двумерном (2D) режиме в этой модели мыши. Иначины опухолей на 7 недель после инфекции отражаются как B-линии в ультразвуковых изображениях, которые могут быть подсчитаны, но не будут отражать точное количество опухолей, присутствующих на легких. B-линии характеризуются лазероподобными вертикальными белыми линиями, вытекающими из плевральной линии в легкей паренхиме7,8. Большие опухоли могут быть визуализированы после 18 недель инфекции. Относительный объем этих опухолей количественно с помощью 2D измерений, проводимых на УЗИ.
Этот метод является оптимальным для исследователей, исследующих влияние фармакологических препаратов на рост опухолей легких в модели мыши LSL-KRAS G12D. Кроме того, прогрессирование опухоли легких можно сравнить между мышами с различными генетическими линиями, чтобы изучить важность наличия или отсутствия определенных генов/белков на развитие объема опухоли легких.
Мы демонстрируем метод, который может оценить рост опухоли легких в Cre-индуцируемой модели мыши LSL-KRAS G12D с помощью ультразвука. Этот метод может быть использован для оценки влияния фармакологических ингибиторов на рост опухоли легких. Он также может быть использован для сравнения роста…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим доктора И. Верму за вектор лентивирного Ca2Cre-shp53. Работа была поддержана за счет средств Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR MOP 137113) в АЕК.
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
FBS | Multicell | 80450 | |
LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |