Questo protocollo descrive i passi adottati per indurre i tumori polmonari KRAS nei topi e la quantificazione dei tumori formati mediante l’imaging ad ultrasuoni. I piccoli tumori sono visualizzati nei primi tempi come linee B. In momenti successivi, le misurazioni relative del volume del tumore vengono ottenute dallo strumento di misurazione nel software a ultrasuoni.
Con 1,6 milioni di dollari di vittime all’anno, il cancro ai polmoni contribuisce enormemente al peso mondiale del cancro. Il cancro del polmone è in parte guidato da alterazioni genetiche in oncogeni come l’oncogene KRAS, che costituisce il 25% dei casi di cancro del polmone. La difficoltà nel colpire terapeuticamente il cancro del polmone guidato da KRAS deriva in parte dall’avere modelli poveri che possono imitare la progressione della malattia in laboratorio. Descriviamo un metodo che permette la quantificazione relativa dei tumori polmonari KRAS primari in un modello di topo LSL-KRAS G12D inducibile in una creme. Questo metodo si basa sull’acquisizione in modalità luminosità (B) del parenchyma polmonare. I tumori che si formano inizialmente in questo modello sono visualizzati come linee B e possono essere quantificati contando il numero di linee B presenti nelle immagini acquisite. Questi rappresenterebbero il numero di tumore relativo formato sulla superficie del polmone del topo. Man mano che i tumori formati si sviluppano con il tempo, sono percepiti come profonde fessure all’interno del parenchyma polmonare. Poiché la circonferenza del tumore formato è ben definita, il calcolo del volume del tumore relativo si ottiene misurando la lunghezza e la larghezza del tumore e applicandole nella formula utilizzata per le misurazioni della pinza del tumore. L’imaging ad ultrasuoni è una tecnica non invasiva, veloce e user-friendly che viene spesso utilizzata per le quantificazioni tumorali nei topi. Sebbene possano apparire artefatti quando si ottengono immagini a ultrasuoni, è stato dimostrato che questa tecnica di imaging è più vantaggiosa per le quantificazioni tumorali nei topi rispetto ad altre tecniche di imaging come l’imaging di tomografia computerizzata (TC) e bioluminescenza (BLI). I ricercatori possono studiare nuovi bersagli terapeutici utilizzando questa tecnica confrontando l’inizio e la progressione del tumore del polmone tra diversi gruppi di topi.
Poiché la principale causa di decessi correlati al cancro in tutto il mondo, il cancro del polmone rimane refrattario ai trattamenti, principalmente a causa della mancanza di modelli preclinici rilevanti che possono ricapitolare la malattia nel laboratorio1. Circa il 25% dei casi di cancro al polmone è dovuto a mutazioni nell’oncogene KRAS2. Il cancro del polmone guidato da KRAS è spesso associato a prognosi infagiola e bassa risposta alla terapia, evidenziando l’importanza di ulteriori studi in questa malattia2.
Abbiamo ottimizzato un metodo che permette la valutazione relativa della crescita del tumore polmonare in tempo reale in topi immuno-competenti indotti dal cancro del polmone KRAS. Usiamo topi Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) in cui l’oncogene KRAS G12D può essere espresso dai vettori lentivirali Cre3,4. Questi vettori sono guidati da anhydraside carbonica 2, permettendo l’infezione virale a prendere posto specificamente nelle cellule epiteliali alveolare5. Inoltre, per accelerare l’inizio e la progressione dei tumori polmonari, il costrutto lentivirale esprime anche lo shRNA P53 da un promotore U6/H1 (il costrutto lentivirale qui sarà indicato come Ca2Cre-shp53)6. La rilevanza biologica di questo metodo sta nel corso naturale dello sviluppo del tumore polmonare nei topi rispetto agli xenografti di tumori non ortotopici nei topi. Un ostacolo che utilizza il metodo ortotopico sta monitorando la crescita del tumore del polmone senza sacrificare il mouse. Per superare questa limitazione, abbiamo ottimizzato l’imaging a ultrasuoni per consentire l’analisi della progressione del tumore polmonare in modalità bidimensionale (2D) in questo modello murino. L’incitamento ai tumori a 7 settimane dopo l’infezione si riflette come linee B in immagini ad ultrasuoni, che possono essere conteggiate, ma non rifletteranno il numero esatto di tumori presenti sul polmone. Le linee B sono caratterizzate da linee bianche verticali simili a laser derivanti dalla linea pleurica nel parenchyma polmonare7,8. I tumori di grandi dimensioni possono essere visualizzati dopo 18 settimane di infezione. Il volume relativo di questi tumori è quantificato da misurazioni 2D fatte su ultrasuoni.
Questo metodo è ottimale per i ricercatori che studiano l’effetto dei farmaci farmacologici sulla crescita del tumore del polmone nel modello murino LSL-KRAS G12D. Inoltre, la progressione del tumore polmonare può essere confrontata tra topi con diversi lignaggi genetici, per esaminare l’importanza della presenza o dell’assenza di alcuni geni/proteine sullo sviluppo del volume del tumore del polmone.
Dimostriamo un metodo in grado di valutare la crescita del tumore polmonare nel modello di topo LSL-KRAS G12D cre-inducibile tramite ultrasuoni. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l’effetto degli inibitori farmacologici sulla crescita del tumore del polmone. Può anche essere utilizzato per confrontare la crescita del tumore polmonare tra topi di diversi background genetici. L’utilizzo di questa tecnica non richiede competenze computazionali specializzate, tuttavia, è importante essere sistematico nel num…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dottor I. Verma per il vettore lentivirale Ca2Cre-shp53. Il lavoro è stato sostenuto da fondi dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) ad AEK.
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
FBS | Multicell | 80450 | |
LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |