Este protocolo descreve as medidas tomadas para induzir tumores pulmonares KRAS em camundongos, bem como a quantificação de tumores formados por ultrassom. Pequenos tumores são visualizados nos primeiros tempos como linhas B. Em momentos posteriores, as medidas relativas do volume tumoral são alcançadas pela ferramenta de medição no software de ultrassom.
Com ~1,6 milhão de vítimas por ano, o câncer de pulmão contribui tremendamente para a carga mundial do câncer. O câncer de pulmão é parcialmente impulsionado por alterações genéticas em oncogenes como o oncogene KRAS, que constitui ~25% dos casos de câncer de pulmão. A dificuldade em mirar terapêuticamente o câncer de pulmão orientado pelo KRAS em parte decorre de ter modelos ruins que podem imitar a progressão da doença em laboratório. Descrevemos um método que permite a quantificação relativa dos tumores pulmonares KRAS primários em um modelo de rato LSL-KRAS G12D cre-induável através de imagens de ultrassom. Este método depende da aquisição do modo de brilho (B) do parenchyma pulmonar. Os tumores que são inicialmente formados neste modelo são visualizados como linhas B e podem ser quantificados contando o número de linhas B presentes nas imagens adquiridas. Estes representariam o número relativo do tumor formado na superfície do pulmão do rato. À medida que os tumores formados se desenvolvem com o tempo, eles são percebidos como fendas profundas dentro do parenchyma pulmonar. Uma vez que a circunferência do tumor formado é bem definida, calcular o volume relativo do tumor é alcançado medindo o comprimento e largura do tumor e aplicando-os na fórmula utilizada para medições de caliper tumoral. A imagem de ultrassom é uma técnica não invasiva, rápida e fácil de usar que é frequentemente usada para quantificações tumorais em camundongos. Embora os artefatos possam aparecer ao obter imagens de ultrassom, mostrou-se que essa técnica de imagem é mais vantajosa para quantificações tumorais em camundongos em comparação com outras técnicas de imagem, como imagens de tomografia computadorizada (TC) e imagem de bioluminescência (BLI). Os pesquisadores podem investigar novos alvos terapêuticos usando essa técnica comparando a iniciação do tumor pulmonar e a progressão entre diferentes grupos de camundongos.
Como a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, o câncer de pulmão permanece refratário aos tratamentos, principalmente pela falta de modelos pré-clínicos relevantes que possam recapitular a doença no laboratório1. Cerca de 25% dos casos de câncer de pulmão são devido a mutações no oncogene KRAS2. O câncer de pulmão orientado por KRAS está frequentemente associado ao mau prognóstico e baixa resposta à terapia, destacando a importância de estudos adicionais nesta doença2.
Otimizamos um método que permite a avaliação relativa do crescimento do tumor pulmonar em tempo real em camundongos imunes induzidos pelo câncer de pulmão do KRAS. Usamos ratos Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) nos quais o oncogene KRAS G12D pode ser expresso pelos vetores cre lentiviral3,4. Esses vetores são impulsionados pela anidrise carbônica 2, permitindo que a infecção viral ocorra especificamente nas células epiteliais aveolar5. Além disso, para acelerar a iniciação e progressão de tumores pulmonares, a construção lentiviral também expressa P53 shRNA de um promotor U6/H1 (a construção lentiviral aqui será referida como Ca2Cre-shp53)6. A relevância biológica desse método está no curso natural do desenvolvimento de tumores pulmonares em camundongos em oposição a xenôenxetos de tumores não ortotópicos em camundongos. Um obstáculo usando o método ortotópico é monitorar o crescimento do tumor pulmonar sem sacrificar o camundongo. Para superar essa limitação, otimizamos a ultrassom para permitir a análise da progressão do tumor pulmonar no modo bidimensional (2D) neste modelo de camundongo. A imitência de tumores a 7 semanas após a infecção se reflete como linhas B em imagens de ultrassom, que podem ser contadas, mas não refletirão o número exato de tumores presentes no pulmão. As linhas B são caracterizadas por linhas brancas verticais semelhantes a laser decorrentes da linha pleural na parenchymapulmonar 7,8. Tumores grandes podem ser visualizados após 18 semanas de infecção. O volume relativo desses tumores é quantificado por medidas 2D feitas no ultrassom.
Este método é ótimo para pesquisadores que investigam o efeito de drogas farmacológicas no crescimento do tumor pulmonar no modelo de camundongos LSL-KRAS G12D. Além disso, a progressão do tumor pulmonar pode ser comparada entre camundongos com diferentes linhagens genéticas, para examinar a importância da presença ou ausência de certos genes/proteínas no desenvolvimento do volume de tumores pulmonares.
Demonstramos um método que pode avaliar o crescimento do tumor pulmonar no modelo de camundongos LSL-KRAS G12D cre-indutor por ultrassom. Este método pode ser usado para avaliar o efeito dos inibidores farmacológicos no crescimento do tumor pulmonar. Também pode ser usado para comparar o crescimento do tumor pulmonar entre camundongos de diferentes origens genéticas. O uso dessa técnica não requer habilidades computacionais especializadas, no entanto, é importante ser sistemático no número de quadros utilizados…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. I. Verma pelo vetor lentiviral Ca2Cre-shp53. O trabalho foi apoiado por fundos dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR MOP 137113) para a AEK.
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
FBS | Multicell | 80450 | |
LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |