Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die unternommen wurden, um KRAS-Lungentumoren bei Mäusen zu induzieren, sowie die Quantifizierung gebildeter Tumoren durch Ultraschallbildgebung. Kleine Tumoren werden in frühen Zeitpunkten als B-Linien visualisiert. Zu späteren Zeitpunkten werden relative Tumorvolumenmessungen durch das Messwerkzeug in der Ultraschallsoftware durchgeführt.
Mit 1,6 Millionen Us-Dollar pro Jahr trägt Lungenkrebs enorm zur weltweiten Belastung durch Krebs bei. Lungenkrebs wird zum Teil durch genetische Veränderungen in Onkogenen wie dem KRAS-Onkogen verursacht, das 25 % der Lungenkrebsfälle ausmacht. Die Schwierigkeit, kraS-getriebenen Lungenkrebs therapeutisch anzusprechen, ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass schlechte Modelle das Fortschreiten der Krankheit im Labor nachahmen können. Wir beschreiben eine Methode, die die relative Quantifizierung von primären KRAS-Lungentumoren in einem creinduzierbaren LSL-KRAS G12D-Mausmodell mittels Ultraschallbildgebung ermöglicht. Diese Methode beruht auf der Helligkeit (B)-Modus Erfassung des Lungenparenchyms. Tumoren, die zunächst in diesem Modell gebildet werden, werden als B-Linien visualisiert und können durch Zählen der Anzahl der In-B-Linien, die in den erfassten Bildern vorhanden sind, quantifiziert werden. Diese würden die relative Tumorzahl darstellen, die auf der Oberfläche der Mauslunge gebildet wird. Wenn sich die gebildeten Tumoren mit der Zeit entwickeln, werden sie als tiefe Spalten im Lungenparenchym wahrgenommen. Da der Umfang des gebildeten Tumors klar definiert ist, wird die Berechnung des relativen Tumorvolumens erreicht, indem die Länge und Breite des Tumors gemessen und in der Für tumorsättelweite Verwendete formelangewendet wird. Ultraschall-Bildgebung ist eine nicht-invasive, schnelle und benutzerfreundliche Technik, die oft für Tumorquantifizierungen bei Mäusen verwendet wird. Obwohl Artefakte auftreten können, wenn Ultraschallbilder erhalten, hat sich gezeigt, dass diese bildgebende Technik für Tumorquantifizierungen bei Mäusen vorteilhafter ist als bei anderen bildgebenden Verfahren wie Computertomographie (CT) Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Forscher können neue therapeutische Ziele mit dieser Technik untersuchen, indem sie die Initiation und Progression von Lungentumoren zwischen verschiedenen Gruppen von Mäusen vergleichen.
Als weltweit führende Ursache für krebsbedingte Todesfälle bleibt Lungenkrebs für Behandlungen refraktär, vor allem aufgrund des Fehlens relevanter präklinischer Modelle, die die Krankheit im Labor rekapitulieren können1. Rund 25% der Lungenkrebsfälle sind auf Mutationen im KRAS-Onkogen2zurückzuführen. KRAS-getriebener Lungenkrebs ist oft mit schlechter Prognose und geringer Reaktion auf die Therapie verbunden, was die Bedeutung weiterer Studien bei dieser Krankheit unterstreicht2.
Wir haben eine Methode optimiert, die die relative Bewertung des Lungentumorwachstums in Echtzeit bei KRAS Lungenkrebs-induzierten immunkompetenten Mäusen ermöglicht. Wir verwenden Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) Mäuse, bei denen das KRAS G12D Onkogen durch Cre lentivirale Vektoren3,4ausgedrückt werden kann. Diese Vektoren werden durch Kohlensäureanhydrase 2 angetrieben, so dass die Virusinfektion speziell in Alveolar-Epithelzellen5stattfinden kann. Um die Initiierung und das Fortschreiten von Lungentumoren zu beschleunigen, drückt das lentivirale Konstrukt auch P53 shRNA von einem U6/H1-Promotor aus (das lentivirale Konstrukt wird hierals Ca2Cre-shp53 bezeichnet)6. Die biologische Relevanz dieser Methode liegt im natürlichen Verlauf der Lungentumorentwicklung bei Mäusen im Gegensatz zu Xenografts von nicht-orthotopischen Tumoren bei Mäusen. Ein Hindernis mit der orthotopischen Methode ist die Überwachung des Lungentumorwachstums, ohne die Maus zu opfern. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir die Ultraschall-Bildgebung optimiert, um die Analyse der Lungentumorprogression im zweidimensionalen (2D) Modus in diesem Mausmodell zu ermöglichen. Die Initiierung von Tumoren nach 7 Wochen nach der Infektion wird als B-Linien in Ultraschallbildern reflektiert, die gezählt werden können, aber nicht die genaue Anzahl der Tumoren in der Lunge widerspiegeln. B-Linien zeichnen sich durch laserartige vertikale weiße Linien aus der Pleuralinie im Lungenparenchym7,8aus. Große Tumore können nach 18 Wochen Der Infektion visualisiert werden. Das relative Volumen dieser Tumoren wird durch 2D-Messungen am Ultraschall quantifiziert.
Diese Methode ist optimal für Forscher, die die Wirkung von pharmakologischen Medikamenten auf das Wachstum des Lungentumors im LSL-KRAS G12D-Mausmodell untersuchen. Darüber hinaus kann die Progression des Lungentumors zwischen Mäusen mit unterschiedlichen genetischen Abstammungslinien verglichen werden, um die Bedeutung des Vorhandenseins oder Fehlens bestimmter Gene/Proteine für die Entwicklung des Lungentumorvolumens zu untersuchen.
Wir zeigen eine Methode, die das Lungentumorwachstum im creinduziblen Mausmodell LSL-KRAS G12D per Ultraschall bewerten kann. Diese Methode kann zur Bewertung der Wirkung von pharmakologischen Inhibitoren auf das Wachstum des Lungentumors verwendet werden. Es kann auch verwendet werden, um Lungentumorwachstum zwischen Mäusen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund zu vergleichen. Die Verwendung dieser Technik erfordert keine speziellen Rechenfertigkeiten, es ist jedoch wichtig, systematisch in der Anzahl der für …
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. I. Verma für den lentiviralen Ca2Cre-shp53 Vektor. Die Arbeit wurde durch Mittel der Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) an AEK unterstützt.
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
FBS | Multicell | 80450 | |
LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |