このプロトコルは、マウスにおけるKRAS肺腫瘍を誘導するために取られたステップと、超音波画像による形成された腫瘍の定量化を記述する。小さな腫瘍は、初期の時間でBラインとして視覚化されます。後の時点で、相対的な腫瘍体積測定は、超音波ソフトウェアの測定ツールによって達成される。
年間160万人の犠牲者を出す肺癌は、世界的ながんの負担に大きく貢献しています。肺癌は、肺癌症例の約25%を構成するKRAS腫瘍遺伝子などの腫瘍遺伝子における遺伝的変化によって部分的に駆動される。KRAS主導の肺癌を治療的に標的化することの難しさは、実験室での病気の進行を模倣できる貧弱なモデルを持つことに部分的に起因する。我々は、超音波画像を介して、Cre-誘導性LSL-KRAS G12Dマウスモデルにおける原発性KRAS肺腫瘍の相対定量を可能にする方法を記載する。この方法は、肺のパレンチマの明るさ(B)モードの獲得に依存する。このモデルで最初に形成された腫瘍はB線として可視化され、取得した画像に存在するB線の数を数えることによって定量化することができる。これらは、マウス肺の表面に形成された相対的な腫瘍番号を表すであろう。形成された腫瘍は時間とともに発達するとともに、肺の中の深い裂け目として知覚される。形成された腫瘍の円周が十分に定義されているので、腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍キャリパー測定に用いる式に適用することにより、相対的な腫瘍体積を計算することが達成される。超音波画像処理は、マウスの腫瘍定量に使用されることが多い非侵襲的で、高速でユーザーフレンドリーな技術です。超音波画像を取得すると人工物が現れる可能性がありますが、このイメージング技術は、コンピュータ断層撮影(CT)イメージングなどの他のイメージング技術と比較して、マウスの腫瘍定量に対してより有利であることがわかりました。生物発光イメージング(BLI)。研究者は、マウスの異なるグループ間の肺腫瘍の開始と進行を比較することによって、この技術を使用して新しい治療標的を調査することができます。
世界中のがん関連死の主な原因として、肺癌は、主に実験室1で病気を再現できる関連する前臨床モデルの欠如のために、治療に耐え難いままである。肺癌症例の約25%はKRASの癌遺伝子2の突然変異によるものである。KRAS駆動肺癌は、しばしば予後不良および治療に対する低応答と関連しており、この疾患におけるさらなる研究の重要性を強調する2。
KRAS肺がんによる免疫力マウスにおいて、肺腫瘍の成長をリアルタイムで相対的に評価できる方法を最適化した。我々は、KRAS G12Dオンコジーンをクレレンチウイルスベクター3、4で発現させることができる、ロクスストップ-ロクスKRAS G12D(LSL-KRAS G12D)マウスを用いる。これらのベクターは、炭酸脱水酵素2によって駆動され、ウイルス感染が肺胞上皮細胞5で特異的に起こるようにする。また、肺腫瘍の開始および進行を促進するために、レンチウイルス構築物は、U6/H1プロモーター(本明細書中のレンチウイルス構築物をCa2Cre-shp53)6と称するP53shRNAを発現する。この方法の生物学的関連性は、マウスの非正所性腫瘍の異種移植片とは対照的に、マウスにおける肺腫瘍の自然な過程にある。正所法を用いた障害は、マウスを犠牲にすることなく肺腫瘍の増殖をモニタリングすることである。この制限を克服するために、我々は、このマウスモデルにおける2次元(2D)モードでの肺腫瘍の進行の分析を可能にするために超音波画像を最適化した。感染後7週で腫瘍を発進させることは、超音波画像のB線として反映され、これは数えることができるが、肺に存在する腫瘍の正確な数を反映しない。B線は、肺のパレンチマ7、8の胸膜線から生じるレーザー状の垂直白線によって特徴付けられる。大きな腫瘍は、感染の18週間後に視覚化することができます。これらの腫瘍の相対的な容積は、超音波で行われる2D測定によって定量化される。
この方法は、LSL-KRAS G12Dマウスモデルにおける肺腫瘍の増殖に対する薬理薬の効果を調べている研究者にとって最適である。さらに、肺腫瘍の進行は、異なる遺伝的系統を有するマウス間で比較することができ、肺腫瘍容積の発達における特定の遺伝子/タンパク質の有無の重要性を調べることができる。
我々は、超音波によるCre-誘導性LSL-KRAS G12Dマウスモデルにおける肺腫瘍の成長を評価できる方法を実証する。この方法は、肺腫瘍の増殖に対する薬理学的阻害薬の効果を評価するために使用することができる。また、異なる遺伝的背景のマウス間の肺腫瘍の成長を比較するために使用することができます。この手法を使用すると、専門的な計算スキルは必要ありませんが、マウスの異なるグ?…
The authors have nothing to disclose.
レンチウイルスCa2Cre-shp53ベクターに対するI.ヴェルマ博士に感謝します。この作業は、カナダ保健研究所(CIHR MOP 137113)からAEKへの資金によって支えられていました。
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
FBS | Multicell | 80450 | |
LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |