Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi
Summary
Burada mikroskopve floresan boyama kullanarak canlı hücre kültüründe makrofaj ekstrasellüler tuzak (MET) üretimini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, immünoresans boyama ile spesifik MET protein belirteçlerini incelemek için daha da genişletilebilir.
Abstract
Nötrofiller tarafından hücre dışı tuzakların (ET) salınımı kronik inflamasyona bağlı hastalıkların gelişimine katkıda bulunan bir faktör olarak tanımlanmıştır. Nötrofil ET’ler (NETs) DNA, histon proteinleri ve çeşitli granül proteinlerinden (yani miyeloperoksidaz, elastaz ve kathepsin G) oluşur. Makrofajlar da dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücreleri, aynı zamanda ET üretebilir; ancak, bunun ne ölçüde meydana geldiği ve makrofaj hücre dışı tuzakların (METs) patolojik mekanizmalarda rol oynayıp oynamadığı ayrıntılı olarak incelenmemiştir. Met’lerin inflamatuar patolojilerde rolünü daha iyi anlamak için, immünoresans deneylerinde de yararlanılabilen primer insan makrofajlarından MET salınımını in vitro olarak görselleştirmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu, bu yapıların daha fazla karakterizasyonuna ve nötrofillerden salınan ED’lerle karşılaştırılmasına olanak sağlar. İnsan monosit kaynaklı makrofajlar (HMDM), M1 pro-inflamatuar fenotipten farklılaşmasını takiben farklı inflamatuar uyaranlara maruz kalındığında MET üretirler. MET salınımı canlı hücreler (örneğin, SYTOX yeşili) için imperkast olan yeşil floresan nükleik asit lekesi kullanılarak mikroskopi ile görselleştirilebilir. HMDM gibi yeni izole edilmiş primer makrofajların kullanımı, potansiyel klinik uygulamalarla ilgili in vivo inflamatuar olayların modelalınmasında avantajlıdır. Bu protokol aynı zamanda insan monosit hücre hatlarından MET salınımını incelemek için de kullanılabilir (örn. THP-1) phorbol myristate asetat veya diğer makrofaj hücre hatları (örn. rürin makrofaj benzeri J774A.1 hücreleri) ile makrofajlara farklılaşmayı takiben.
Introduction
Nötrofillerden edinen ET salınımı ilk olarak bakteriyel enfeksiyon tarafından tetiklenen doğuştan gelen bir immün yanıt olarak tanımlanmıştır1. Nötrofil elastaz ve miyeloperoksidaz2gibi anti-bakteriyel özelliklere sahip çeşitli granül proteinlerin bağlı olduğu bir DNA omurgası oluşur. Nötrofil ETs birincil rolü (NETs) patojenleri yakalamak ve bunların ortadan kaldırılması kolaylaştırmaktır 3. Bununla birlikte, immün savunmada ET’lerin koruyucu rolüne ek olarak, özellikle inflamasyona dayalı hastalıkların (örneğin romatoid artrit ve ateroskleroz4). ET salınımı interlökin 8 (IL-8) ve tümör nekroz faktörü alfa (TNFα)5,6dahil olmak üzere çeşitli pro-inflamatuar sitokinler tarafından tetiklenebilir ve ET’lerin lokalize birikimi doku hasarı artırabilir ve bir uyandırmak pro-inflamatuar yanıt7. Örneğin, ET’ler ateroskleroz gelişiminde nedensel bir rol oynadığı için karıştığı edilmiştir8, tromboz teşvik9, ve kardiyovasküler risk tahmin10.
Şimdi nötrofiller ek olarak, diğer bağışıklık hücreleri (yani, mast hücreleri, eozinofiller, ve makrofajlar) ayrıca mikrobiyal veya pro-inflamatuar stimülasyon 11 ,12maruz kalma ET’ler serbest bırakabilirsiniz kabul edilmektedir. Bu durum, kronik inflamatuar hastalıkların gelişiminde, düzenlenmesinde ve çözümünde kilit rol oynadıkları göz önünde bulundurularak makrofajlar açısından özellikle önemli olabilir. Bu nedenle, makrofajlar et sürümü ve inflamasyona bağlı hastalık gelişimi arasındaki potansiyel ilişki daha iyi anlaşılması önemlidir. Son çalışmalar sağlam insan aterosklerotik plaklar ve organize trombüs13METs ve NETs varlığını göstermiştir. Benzer şekilde, METs inflamatuar yanıtların düzenlenmesi ile böbrek hasarı sürüş karıştığı edilmiştir14. Ancak nötrofillerin aksine makrofajlardan MET oluşumu mekanizmaları hakkında sınırlı veri vardır. MET oluşumuinsan in vitro modellerini kullanarak yapılan son çalışmalar, her hücre tipinde yer alan yollarda bazı farklılıklar göstermektedir (yani, makrofajlarla histon sitrullination yokluğu ile ilgili)6. Ancak, bazı NET sürümü de histon sitrullination yokluğunda oluşabilir göstermiştir15.
Bu protokolün genel amacı, MET salınımını klinik olarak ilgili bir makrofaj modelinde değerlendirmek için basit ve doğrudan bir yöntem sağlamaktır. MET’leri incelemek için kullanılan farklı in vitro makrofaj hücre modelleri vardır (yani, THP-1 insan monosit hücre hattı ve çeşitli murine makrofaj hücre hatları)16. Bu modeller ile ilişkili bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, THP-1 monositlerinin makrofajlara farklılaşması genellikle protein kinaz C (PKC) bağımlı yolları aktive eden phorbol myristate asetat (PMA) eklenmesi gibi bir astar adım gerektirir. Bu işlem ET salınımıtetiklediği bilinmektedir 4 ve THP-1 hücrelerinden düşük bazal MET sürümü ile sonuçlanır. Diğer çalışmalar pma tedavi THP-1 hücreleri17ile karşılaştırıldığında in vivo makrofajlar tarafından monte biyoaktivite ve inflamatuar yanıtları bazı farklılıklar vurgulamıştır.
Benzer şekilde, farklı murine makrofaj benzeri hücre hatlarının davranışı ve inflamatuar yanıtları tamamen birincil insan makrofajlarının yanıt spektrumu temsil etmez18. Bu nedenle, klinik ortamda makrofaj ET oluşumunu araştırmak amacıyla, birincil insan monosit kaynaklı makrofajlar (HMDM) monositik veya murine makrofaj benzeri hücre hatları yerine daha alakalı bir model olduğuna inanılmaktadır.
M1 polarize HMDM et sürümü farklı inflamatuar uyaranların bir dizi bu hücrelerin maruz kalma sonrasında gösterilmiştir, miyeloperoksidaz türetilmiş oksidan hipokloröz asit de dahil olmak üzere (HOCl), PMA, TNFα, ve IL-86. Burada açıklanan M1 fenotip HMDMs polarize etmek ve bu inflamatuar uyaranlara maruz kalma üzerine sonraki MET sürümü görselleştirmek için bir protokoldür. PMA nötrofil kullanmış önceki çalışmalara karşılaştırmaları kolaylaştırmak için MET sürümü bir uyarıcı olarak kullanılır. Daha da önemlisi, HOCl, IL-8, ve TNFα da MET salınımını uyarmak için kullanılır, hangi in vivo inflamatuar ortamın daha iyi modelleri olduğuna inanılmaktadır. ET salınımını görselleştirme için mikroskobik yöntem, önceki nötrofil çalışmalarında başarıyla uygulanmış bir geçirimsiz floresan yeşil nükleik asit lekesi olan SYTOX yeşili kullanılarak canlı hücre kültürlerinde hücre dışı DNA’nın boyanmasını içerir. Bu yöntem ET salınımının hızlı ve nitel olarak değerlendirilmesine olanak sağlar, ancak ET salınım kapsamının nicelleştirilmesi için tek başına bir yöntem olarak uygun değildir. Farklı tedavi koşullarından veya müdahalelerden kaynaklanan ET salınımının kapsamını karşılaştırmak için niceleme gerekiyorsa alternatif metodoloji kullanılmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
M1 diferansiye HMDM’ler kullanılarak MET oluşumunun oluşturulması ve görselleştirilmesi, özellikle kronik inflamatuar altında, bu makrofaj yapıların potansiyel patolojik rolünü araştırmak için yararlı olabilecek yeni bir in vitro modeli temsil eder Koşul -ları. Aynı zamanda insan monosit veya murine makrofaj hücre hatları ile ilgili çalışmalarda kullanılabilir METs serbest bırakmak için birincil insan makrofajların uyarılması için sağlam bir protokol sağlar. HMDM tarafından MET oluşumun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sürekli IMPACT Hibesi (IPAP201601422) ve Novo Nordisk Vakfı Biyomedikal Proje Hibesi (NNF17OC0028990) tarafından desteklenmiştir. YZ ayrıca Sydney Üniversitesi’nden Avustralya Lisansüstü Ödülü’nü kabul eder. Biz monosit izolasyon ve doku kültürü ile yardım için Bay Pat Pisansarakit ve Bayan Morgan Jones teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
