Summary

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

Published: November 01, 2019
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Summary

Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Abstract

A liberação de armadilhas extracelulares (ETs) por neutrófilos tem sido identificada como um fator contribuinte para o desenvolvimento de doenças relacionadas à inflamação crônica. ETs neutrófilos (NETs) consistem em uma malha de DNA, proteínas histona e várias proteínas de grânulo (ou seja, mieloperoxidase, elastase e cateterasina G). Outras células imunes, incluindo macrófagos, também podem produzir ETs; no entanto, até que ponto isso ocorre in vivo e se as armadilhas extracelulares de macrófagos (METs) desempenham um papel nos mecanismos patológicos não foi examinada em detalhes. Para entender melhor o papel dos METs em patologias inflamatórias, um protocolo foi desenvolvido para visualizar a liberação met de macrófagos humanos primários in vitro, que também pode ser explorado em experimentos de imunofluorescência. Isso permite uma maior caracterização dessas estruturas e sua comparação com ETs liberados de neutrófilos. Macrófagos derivados de monócito santem (HMDM) produzem METs após a exposição a diferentes estímulos inflamatórios após a diferenciação do fenótipo pró-inflamatório M1. A liberação de METs pode ser visualizada por microscopia usando uma mancha de ácido nucleico fluorescente verde que é imperdestina às células vivas (por exemplo, verde SYTOX). O uso de macrófagos primários recém-isolados, como o HMDM, é vantajoso na modelagem de eventos inflamatórios in vivo que são relevantes para potenciais aplicações clínicas. Este protocolo também pode ser usado para estudar a liberação met de linhas celulares monócitos humanos (por exemplo, THP-1) após a diferenciação em macrófagos com acetato phorbol myristate ou outras linhas celulares de macrófagos (por exemplo, as células J774A.1 murine macrófagos).

Introduction

A liberação de ETs de neutrófilos foi identificada pela primeira vez como uma resposta imune inata desencadeada pela infecção bacteriana1. Eles consistem em uma espinha dorsal de DNA para que várias proteínas de grânulo com propriedades antibacterianas estão ligadas, incluindo elastase neutrófilo e mieloperoxidase2. O principal papel dos ETs neutrófilos (NETs) é capturar patógenos e facilitar a sua eliminação3. No entanto, além do papel protetor dos ETs na defesa imunológica, um número crescente de estudos também descobriu um papel na patogênese da doença, particularmente durante o desenvolvimento de doenças transmitidas por inflamação (ou seja, artrite reumatóide e aterosclerose4). A liberação de ETs pode ser desencadeada por várias citocinas pró-inflamatórias, incluindo interleucina 8 (IL-8) e fator de necrose tumoral alfa (TNFα)5,6, e o acúmulo localizado de ETs pode aumentar os danos nos tecidos e evocar um resposta pró-inflamatória7. Por exemplo, os ETs têm sido implicados como desempenhando um papel causal no desenvolvimento da aterosclerose8,promovendo a trombose9,e prevendo o risco cardiovascular10.

Agora é reconhecido que, além de neutrófilos, outras células imunes (ou seja, células de mastro, eosinófilos e macrófagos) também podem liberar ETs na exposição à estimulação microbiana ou pró-inflamatória11,12. Isso pode ser particularmente significativo no caso dos macrófagos, considerando seu papel fundamental no desenvolvimento, regulação e resolução de doenças inflamatórias crônicas. Portanto, é importante obter uma maior compreensão da relação potencial entre a liberação de ET de macrófagos e desenvolvimento de doenças relacionadas à inflamação. Estudos recentes têm mostrado a presença de METs e NETs em placas ateroscleróticas humanas intactas etrombo13organizado. Da mesma forma, mets têm sido implicados na condução de lesões renais através da regulação de respostas inflamatórias14. No entanto, em contraste com os neutrófilos, existem dados limitados sobre os mecanismos de formação met de macrófagos. Estudos recentes usando modelos in vitro humanos de formação MET mostram algumas diferenças nas vias envolvidas em cada tipo de célula (ou seja, em relação à ausência de citrulização histona com macrófagos)6. No entanto, alguns mostraram que a liberação net também pode ocorrer na ausência de histona ciitrullination15.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método simples e direto para avaliar a liberação do MET em um modelo de macrófago clinicamente relevante. Existem uma série de diferentes modelos de células de macrófagos in vitro que têm sido usados para estudar METs (ou seja, a linha de células monócito humana THP-1 e várias linhas de células demacrófagosmurine) 16 . Existem algumas limitações associadas a esses modelos. Por exemplo, a diferenciação de monócitos THP-1 para macrófagos geralmente requer um passo de preparação, como a adição de acetato phorbol myristate (PMA), que por si só ativa proteína kinase C (PKC) vias dependentes. Este processo é conhecido por desencadear a liberação de ET4 e resulta em uma liberação baixo basal MET de células THP-1. Outros estudos destacaram algumas diferenças na bioatividade e respostas inflamatórias montadas por macrófagos in vivo em comparação com as células THP-1 tratadas com PMA17.

Da mesma forma, o comportamento e as respostas inflamatórias de diferentes linhas celulares semelhantes a macrófagos de urina não representam completamente o espectro de resposta dos macrófagos humanos primários18. Portanto, com a finalidade de investigar a formação de ET de macrófagos no ambiente clínico, acredita-se que os macrófagos humanos primários derivados de monócito (HMDMs) sejam um modelo mais relevante do que linhas celulares monocíticas ou murina semelhantes a macrófagos.

A liberação de ET de HMDMs polarizados M1 foi demonstrada após a exposição dessas células a uma série de diferentes estímulos inflamatórios, incluindo o ácido ocorrecloloso oxidante derivado da mieloperoxidase (HOCl), PMA, TNFα e IL-86. Descrito aqui é um protocolo para polarizar HMDMs ao fenótipo M1 e visualizar a liberação met subseqüente após a exposição a esses estímulos inflamatórios. Pma é usado como um estímulo de liberação MET para facilitar comparações com estudos anteriores que usaram neutrófilos. Importante, HOCl, IL-8, e TNFα são usados igualmente para estimular a liberação MET, que são acreditadas para ser melhores modelos do ambiente inflamatório in vivo. O método microscópico para visualização da liberação de ET envolve a coloração do DNA extracelular em culturas de células vivas usando o verde SYTOX, uma mancha de ácido nucleico verde fluorescente impermeável que tem sido aplicada com sucesso em estudos anteriores de neutrófilos. Este método permite uma avaliação rápida e qualitativa da liberação de ET, mas não é apropriado como um método autônomo para a quantificação da extensão de liberação de ET. Metodologia alternativa deve ser usada se a quantificação for necessária para comparar a extensão da liberação de ET resultante de diferentes condições ou intervenções de tratamento.

Protocol

O HMDM foi isolado das preparações humanas do revestimento do buffy fornecidas pelo banco de sangue com aprovação das éticas do distrito de saúde local de Sydney. 1. Hmdm Cultura Isolar os monócitos de preparações de casaco sinuoso preparado a partir do sangue periférico de doadores humanos saudáveis usando uma preparação comercialmente disponível para isolar linfócitos, seguido por elutriação centrífuga contracorrente19, <sup clas…

Representative Results

Imagens de Brightfield mostrando as mudanças morfológicas do HMDM em resposta a estímulos para diferenciação celular são mostradas na Figura 1. M1 polarizado macrófagos de experimentos com HMDM expostos a IFNγ e LPS mostrou uma forma de célula alongada e fuso- como, como indicado pelas setas pretas na Figura 1 (painel médio). Para comparação, a morfologia dos macrófagos polarizados M2 após a exposição de HMDM a IL-4 para 48 h era tipicamente redo…

Discussion

A geração e visualização da formação MET utilizando HmDMs diferenciados de M1 representa um novo modelo in vitro que pode ser útil para investigar o potencial papel patológico dessas estruturas de macrófagos, particularmente inflamatória crônica Condições. Ele fornece um protocolo robusto para a estimulação de macrófagos humanos primários para liberar METs, que também podem ser utilizados em estudos relacionados com monocyte humano ou linhas de células macrófagos de urina. A implementação bem-sucedi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por um Perpetual IMPACT Grant (IPAP201601422) e novo Nordisk Foundation Biomedical Project Grant (NNF17OC0028990). YZ também reconhece o recebimento de um Prêmio de Pós-Graduação Australiana da Universidade de Sydney. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Pat Pisansarakit e à Sra. Morgan Jones pela ajuda com o isolamento monócito e a cultura dos tecidos.

Materials

120Q broad spectrum fluorescent light source EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) Sigma-Aldrich CLS3336 For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) Polysciences Inc. 24606 Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS) Thermo-Fisher 14025050 For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl) Sigma-Aldrich 320331 For MET stimulation
Interferon gamma Thermo-Fisher PMC4031 For M1 priming
Interleukin 4 Integrated Sciences rhil-4 For M2 priming
Interleukin 8 Miltenyl Biotec 130-093-943 For MET stimulation
L-Glutamine Sigma-Aldrich 59202C Added to culture media
Lipopolysaccharide Integrated Sciences tlrl-eblps For M1 priming
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS 1114544 For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D5652 For washing steps
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R8758 For cell culture
SYTOX green Life Technologies S7020 For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source Olympus, Tokyo, Japan x-cite series
Tumor necrosis factor alpha Lonza 300-01A-50 For MET stimulation

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Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).

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