في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة
Summary
المقدمة هنا هو بروتوكول للكشف عن الإنتاج الضام (MET) فخ خارج الخلية في ثقافة الخلايا الحية باستخدام المجهر وتلطيخ فلوري. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لدراسة محدده علامات البروتين التقي بتلطيخ المناعي.
Abstract
تم تحديد الإفراج عن الفخاخ خارج الخلية (ETs) من العدلات باعتبارها عاملا مساهما في تطوير الامراض المتعلقة بالتهاب مزمن. العدلات ETs (الناموسيات) تتكون من شبكه من الحمض النووي ، والبروتينات هيستون ، والبروتينات الحبيبية المختلفة (اي ، الميلوكسيداز ، اللدائن ، و كاتيبسين G). الخلايا المناعية الأخرى ، بما في ذلك الضامة ، ويمكن أيضا ان تنتج ETs ؛ ومع ذلك ، إلى اي مدي يحدث هذا في الجسم الآخر وما إذا كانت الفخاخ خارج الخلية الضامة (ميتس) تلعب دورا في أليات المرضية لم يتم فحصها بالتفصيل. لفهم أفضل دور ميتس في الامراض التهابيه ، تم تطوير بروتوكول لتصور الإفراج عن التقي من الضامة البشرية الاوليه في المختبر ، والتي يمكن أيضا ان تستغل في التجارب المناعية. وهذا يسمح بمزيد من توصيف هذه الهياكل ومقارنتها مع ETs الصادرة من العدلات. الضامة البشرية المشتقة من الخلايا (HMDM) تنتج ميتس عند التعرض لمحفزات التهابيه مختلفه بعد التمايز إلى النمط الظاهري M1 الموالية للالتهابات. ويمكن تصور الإفراج عن ميتس عن طريق المجهر باستخدام الأخضر الفلورسنت وصمه عار الحمض النووي التي يتم تعريضها للخطر الخلايا الحية (علي سبيل المثال ، SYTOX الخضراء). استخدام الضامة الابتدائية المعزولة الطازجة ، مثل HMDM ، هو مفيد في النمذجة في الظواهر التهابيه الجسم التي هي ذات الصلة للتطبيقات السريرية المحتملة. ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لدراسة الإفراج عن الخلايا البشرية الاحاديه الخلية (علي سبيل المثال ، thp-1) بعد التمايز في الضامة مع خلات ميريستات phorbol أو غيرها من خطوط الخلايا الضامة (علي سبيل المثال ، الضامة murine-مثل الخلايا J774A).
Introduction
تم تحديد الإفراج عن ETs من العدلات لأول مره كاستجابة مناعية فطريه الناجمة عن العدوى البكتيرية1. وهي تتكون من العمود الفقري الحمض النووي التي ترتبط البروتينات الحبيبية المختلفة مع خصائص مضاده للبكتيريا ، بما في ذلك اللدائن العدلات و myeloperoxidase2. الدور الرئيسي لل العدلات (الناموسيات) هو للقبض علي مسببات الامراض وتسهيل القضاء عليها3. ومع ذلك ، بالاضافه إلى دور وقائي من ETs في الدفاع المناعي ، وقد اكتشف عدد متزايد من الدراسات أيضا دورا في الامراض المرضية ، وخاصه خلال تطوير امراض يحركها التهاب (اي التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين4). ويمكن تشغيل الإفراج عن ETs من قبل مختلف السايتوكينات الموالية للالتهابات بما في ذلك انترلوكين 8 (آيل-8) وعامل نخر الورم الفا (tnfα)5،6، وتراكم المترجمة من ets يمكن ان تزيد من تلف الانسجه واستحضار استجابه الموالية للالتهابات7. علي سبيل المثال, وقد تورطت ETs كما لعب دورا سببيه في تطوير تصلب الشرايين8, تعزيز تخثر9, وتوقع مخاطر القلب والاوعيه الدموية10.
ومن المسلم به الآن انه بالاضافه إلى العدلات, الخلايا المناعية الأخرى (اي, الخلايا البدينة, الحمضات, والضامة) يمكن أيضا الإفراج عن ETs علي التعرض للتحفيز الميكروبية أو الموالية للالتهابات11,12. قد يكون هذا مهما بشكل خاص في حاله الضامة ، بالنظر إلى دورها الرئيسي في تطوير وتنظيم وحل الامراض التهابيه المزمنة. ولذلك ، من المهم الحصول علي فهم أكبر للعلاقة المحتملة بين الإفراج عن ET من الضامة والامراض المرتبطة بالتهاب التنمية. وقد أظهرت الدراسات الاخيره وجود ميتس والشباك في لويحات تصلب الشرايين البشرية سليمه ونظمت الجلطات13. المثل, وقد تورط ميتس في القيادة أصابه الكلي من خلال تنظيم الاستجابات التهابيه14. ومع ذلك ، وعلي النقيض من العدلات ، وهناك بيانات محدوده عن أليات تشكيل اجتمع من الضامة. الدراسات الاخيره باستخدام نماذج الإنسان في المختبر من تشكيل اجتمع تظهر بعض الاختلافات في مسارات المشاركة في كل نوع الخلية (اي ، فيما يتعلق بعدم وجود هيستون سيترولينيشن مع الضامة)6. ومع ذلك ، فقد أظهرت بعض ان الإفراج عن NET يمكن ان يحدث أيضا في غياب هيستون سيترولينيشن15.
الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير طريقه بسيطه ومباشره لتقييم الإفراج عن الوفاء في نموذج الضامة ذات الصلة سريريا. وهناك عدد من مختلف في المختبر نماذج الخلايا الضامة التي تم استخدامها لدراسة ميتس (اي THP-1 خط خليه الخلايا الاحاديه الإنسان ومختلف خطوط الخلايا الضامة murine)16. هناك بعض القيود المرتبطة بهذه النماذج. علي سبيل المثال ، التمايز من الخلايا الاحاديه thp-1 إلى الضامة عاده ما يتطلب خطوه فتيله ، مثل أضافه خلات phorbol ميريستات (نقدا) ، الذي ينشط نفسه البروتين كيناز C (pkc)-المسارات التابعة. ومن المعروف هذه العملية لتشغيل ET الإصدار4 والنتائج في القاعدية منخفضه التقي الإفراج من خلايا thp-1. وقد أبرزت دراسات أخرى بعض الاختلافات في النشاط البيولوجي والاستجابات التهابيه التي شنتها الضامة في الجسم الحيوي مقارنه مع الخلايا المعالجة بالنقد العامل THP-117.
المثل ، فان السلوك والاستجابات التهابيه من مختلف خطوط الخلايا الضامة murine لا تمثل تماما طيف الاستجابة من الضامة البشرية الاوليه18. ولذلك ، لغرض التحقيق في تكوين الضامة ET في البيئة السريرية ، ويعتقد ان الضامة البشرية الاوليه المشتقة (HMDMs) نموذج أكثر ملاءمة بدلا من الخلايا الاحاديه أو murine الضامة مثل خطوط الخلية.
وقد ثبت ET الإفراج عن HMDMs M1 الاستقطاب التالية التعرض لهذه الخلايا لعدد من المحفزات التهابيه المختلفة ، بما في ذلك الأحماض المؤكسدة المشتقة الميلوكسيداز (الحسين) ، ونقدا ، TNFα ، و IL-86. وصف هنا هو بروتوكول لاستقطاب HMDMs إلى النمط الظاهري M1 وتصور الإفراج عن اللاحقة التقي عند التعرض لهذه المحفزات التهابيه. وتستخدم هذه النقد كحافز للإفراج عن الاجتماعات لتسهيل مقارنات الدراسات السابقة التي استخدمت العدلات. الأهم من ذلك ، يتم استخدام الهوكي ، آيل-8 ، و TNFα أيضا لتحفيز الإفراج عن الوفاء ، والتي يعتقد انها أفضل نماذج من البيئة التهابيه في الجسم الفيفو. الطريقة المجهرية لتصور الإفراج عن ET ينطوي تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية في ثقافات الخلايا الحية باستخدام الأخضر SYTOX ، وهو الفلورية الخضراء الفلورسنت وصمه عار التي تم تطبيقها بنجاح في الدراسات العدلات السابقة. وتسمح هذه الطريقة بالتقييم السريع والنوعي للإصدار ET ، ولكنها ليست مناسبه كطريقه قائمه بذاتها للقياس الكمي لمدي الإفراج عن ET. وينبغي استخدام المنهجية البديلة إذا اقتضى الأمر القياس الكمي لمقارنه مدي الإفراج عن البيانات التعريفية الناتجة عن ظروف أو تدخلات علاجيه مختلفه.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجيل والتصور من تشكيل اجتمع باستخدام M1 المتمايزة HMDMs يمثل نموذج جديد في المختبر التي قد تكون مفيده للتحقيق في الدور المرضي المحتملة لهذه الهياكل الضامة ، وخاصه تحت التهابات مزمنة الظروف. ويوفر بروتوكولا قويا لتحفيز الضامة البشرية الاوليه للإفراج عن ميتس ، والتي يمكن أيضا ان تستخدم في ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه الأثر الدائم (IPAP201601422) ومنحه المشروع الطبي الحيوي لمؤسسه نوفو نورديسك (NNF17OC0028990). كما يعترف باستلام الجائزة الاستراليه للدراسات العليا من جامعه سيدني. ونود ان نشكر السيد بات بيسساراكسيت والسيدة مورغان جونز علي المساعدة في العزلة الاحاديه وثقافة الانسجه.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
