분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 현미경 및 형광 염색을 사용하여 살아있는 세포 배양에서 대식세포 외 트랩(MET) 생산을 검출하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 특정 MET 단백질 마커를 검사하기 위해 더 확장될 수 있다.
Abstract
호중구에 의한 세포외 트랩(ETs)의 방출은 만성 염증과 관련된 질병의 발병에 기여하는 요인으로 확인되었습니다. 호중구 ETs (NETs)는 DNA, 히스톤 단백질 및 다양한 과립 단백질 (즉, 골수 페록시다제, 엘라스타아제 및 카테신 G)의 메쉬로 구성됩니다. 대 식 세포를 포함 하 여 다른 면역 세포, 또한 ETs를 생산할 수 있습니다.; 그러나, 이것이 생체 내에서 어느 정도 발생하고 대식세포 외 트랩(METs)이 병리학적 메커니즘에서 역할을 하는지 여부는 구체적으로 조사되지 않았다. 염증성 병리학에서 MET의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 면역 형광 실험에서 악용될 수 있는 시험관 내 1차 인간 대식세포로부터 MET 방출을 시각화하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 이것은 이 구조물의 추가 특성화 및 호중구에서 풀어 놓인 ETs에 그들의 비교를 허용합니다. 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDM)는 M1 프로-염증 표현형에 대한 분화 후 상이한 염증 자극에 노출시 MET를 생성한다. MET의 방출은 살아있는 세포 (예를 들어, SYTOX 녹색)에 불침투되는 녹색 형광 핵산 얼룩을 사용하여 현미경 검사법에 의해 가시화 될 수 있습니다. HMDM과 같은 갓 분리된 1차 대식세포의 사용은 잠재적인 임상 적용과 관련된 생체 내 염증 성 이벤트를 모델링하는 데 유리합니다. 이 프로토콜은 또한 인간 단핵구 세포주(예를 들어, THP-1)로부터의 MET 방출을 연구하기 위해 포르볼 마이리스테이트 아세테이트 또는 다른 대식세포 세포주(예를 들어, 뮤린 대식세포-유사 J774A.1 세포)를 이용한 대식세포로의 분화에 사용될 수 있다.
Introduction
호중구에서 ETs의 방출은 세균성 감염에 의해 시작되는 선천적인 면역 반응으로 처음 확인되었습니다1. 그(것)들은 항균 특성을 가진 각종 과립 단백질이 호중구 엘라스타아제 및 골수페록시다아제2를포함하여 결합되는 DNA 백본으로 이루어져 있습니다. 호중구 ETs (NETs)의 주요 역할은 병원체를 포착하고 그들의 제거를 촉진하는것입니다 3. 그러나, 면역 방어에 있는 ETs의 보호 역할 이외에, 연구 결과의 증가는 또한 질병 병인에 있는 역할을, 특히 염증 구동한 질병의 발달 도중 발견했습니다 (즉, 류마치스성 관절염 및 죽상 동맥 경화증4). ETs의 방출은 인터류킨 8 (IL-8) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)5,6,및 국부적 인 축적을 포함한 다양한 염증성 사이토카인에 의해 유발될 수 있으며, ET의 국소축적은 조직 손상을 증가시키고 불러일으키고 프로 염증 반응7. 예를 들어, ETs는 동맥경화증8의발달에 인과적 역할을 하는 것으로, 혈전증9를촉진하고, 심혈관위험도 10을예측하는 것으로 연루되어 왔다.
이제 호중구 이외에, 다른 면역 세포(즉, 비만 세포, 호산구, 및 대식세포)가 미생물 또는 프로-염증 자극에 노출될 때 ET를 방출할 수 있다는 것을 인식하고있다 11,12. 이것은 만성 염증성 질병의 발달, 규칙 및 해결에 있는 그들의 중요한 역할을 고려하여 대식세포의 경우에 특히 중요할 지도 모릅니다. 따라서 대식세포에서 ET 방출과 염증 관련 질병 개발 사이의 잠재적 인 관계를 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 최근 연구는 그대로 인간의 죽상 경화성 플라크와 조직 혈전13에METs와 NETs의 존재를 보여 주었다. 유사하게, MET는 선동적인 반응의 규정을 통해 신장 상해를 운전에 연루되었습니다14. 그러나, 호중구와는 달리, 대식세포로부터의 MET 형성 메커니즘에 대한 제한된 데이터가 있다. MET 형성의 인간 체외 모델을 이용한 최근 연구는 각 세포 유형에 관여하는 경로에 약간의 차이를 보여준다 (즉, 대식세포와 히스톤 시트룰린의 부재에 관한)6. 그러나, 일부는 NET 방출이 히스톤 시트룰린(15)의부재에서 발생할 수 있음을 보여 주었다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 임상적으로 관련된 대식세포 모델에서 MET 방출을 평가하는 간단하고 직접적인 방법을 제공하는 것입니다. METs(즉, THP-1 인간 단핵구 세포주 및 다양한 뮤린 대식세포 세포주)를 연구하기 위해 사용되어 온 여러 가지 시험관내 대식세포 세포 모델이있다 16. 이러한 모델과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시키는 것은 일반적으로 단백질 키나아제 C(PKC) 의존적 경로를 활성화시키는 포르볼 마이스테이트 아세테이트(PMA)의 첨가와 같은 프라이밍 단계를 필요로 한다. 이 과정은 ET 방출4를 트리거하는 것으로 알려져 있으며 THP-1 세포로부터 낮은 기저 MET 방출을 초래한다. 다른 연구는 PMA 처리 된 THP-1세포17에비해 생체 내에서 대식세포에 의해 장착 된 생체 활성 및 염증 반응의 몇 가지 차이점을 강조했다.
유사하게, 상이한 뮤린 대식세포유사 세포주들의 거동및 염증반응은 1차 인간 대식세포의 반응 스펙트럼을 완전히 나타내지않는다(18). 따라서, 임상 적 설정에서 대식세포 ET 형성을 조사하기 위한 목적으로, 1차 인간 단핵구 유래 대식세포(HMDMs)는 단낭 또는 무린 대식세포 유사 세포주보다는 보다 관련성이 있는 모델로 여겨진다.
M1 편광 HMDMs로부터의 ET 방출은 골수페록시다아제 유래 산화하이포염소산(HOCl), PMA, TNFα 및 IL-86을포함하는 다수의 상이한 염증 자극에 이들 세포를 노출시킨 후 입증되었다. 여기서 설명된 프로토콜은 HMDM을 M1 표현형으로 편광시키고 이러한 염증 자극에 노출될 때 후속 MET 방출을 시각화하는 프로토콜이다. PMA는 호중구를 사용한 이전 연구와의 비교를 용이하게 하기 위해 MET 방출의 자극으로 사용됩니다. 중요하게도, HOCl, IL-8, 및 TNFα는 또한 생체 내에서 염증 환경의 더 나은 모델로 여겨지는 MET 방출을 자극하는데 사용된다. ET 방출의 가시화를 위한 현미경 방법은 SYTOX 녹색을 사용하여 살아있는 세포 배양에 있는 세포외 DNA를 염색하는 관련시킵니다, 이전 호중구 연구 결과에서 성공적으로 적용된 불투과성 형광 녹색 핵산 얼룩. 이 방법은 ET 방출의 신속하고 질적 평가를 허용하지만 ET 방출 범위의 정량화를 위한 독립형 방법으로는 적절하지 않다. 다른 처리 조건 또는 내정간섭에서 유래한 ET 방출의 넓이비교하기 위하여 정량화가 요구되는 경우에 대체 방법론을 이용되어야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
M1 분화된 HMDMs를 이용한 MET 형성의 생성 및 시각화는 이러한 대식세포 구조의 잠재적인 병리학적 역할을 조사하는 데 유용할 수 있는 새로운 시험관 내 모델을 나타내며, 특히 만성 염증성 하에서 조건. 그것은 또한 인간 단핵구 또는 뮤린 대식세포 세포주를 가진 관련 연구 결과에서 이용될 수 있는 MET를 풀어 주기 위하여 1 차적인 인간 대식세포의 자극을 위한 강력한 프로토콜을 제공합니다. HMDM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 영구 충격 보조금 (IPAP201601422)과 노보 노디스크 재단 생물 의학 프로젝트 보조금 (NNF17OC0028990)에 의해 지원되었다. YZ는 또한 시드니 대학에서 호주 대학원 상을 수상한 것을 인정합니다. 우리는 단핵구 격리 및 조직 문화에 도움을 주셔서 씨 팻 피산사라킷과 모건 존스 씨에게 감사드립니다.
Materials
| 120Q broad spectrum fluorescent light source | EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada | x-cite series | |
| Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) | Sigma-Aldrich | CLS3336 | For cell culture |
| Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) | Polysciences Inc. | 24606 | Characterisation of monocytes |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14025050 | For washing steps and HOCl treatment |
| Hypochlorous acid (HOCl) | Sigma-Aldrich | 320331 | For MET stimulation |
| Interferon gamma | Thermo-Fisher | PMC4031 | For M1 priming |
| Interleukin 4 | Integrated Sciences | rhil-4 | For M2 priming |
| Interleukin 8 | Miltenyl Biotec | 130-093-943 | For MET stimulation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 59202C | Added to culture media |
| Lipopolysaccharide | Integrated Sciences | tlrl-eblps | For M1 priming |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS | 1114544 | For isolation of monocytes |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan | ||
| Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | For MET stimulation |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D5652 | For washing steps |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | For cell culture |
| SYTOX green | Life Technologies | S7020 | For MET visulaization |
| TH4-200 brightfield light source | Olympus, Tokyo, Japan | x-cite series | |
| Tumor necrosis factor alpha | Lonza | 300-01A-50 | For MET stimulation |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
- Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
- Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
- Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
- Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
- Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
- Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
- Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
- Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
- Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
- Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
- Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).
