Summary

В экстракорпоральная стимуляция и визуализация внеклеточной ловушки релиз в дифференцированных человеческих моноцитов полученных макрофагов

Published: November 01, 2019
doi:

Summary

Представлен протокол для обнаружения макрофагов внеклеточной ловушки (MET) производства в живой культуре клеток с помощью микроскопии и флуоресценции окрашивания. Этот протокол может быть расширен для изучения конкретных маркеров белка MET путем окрашивания иммунофлюоресценции.

Abstract

Выброс внеклеточных ловушек (ЭТ) нейтрофилов был определен в качестве фактора, способствующего развитию заболеваний, связанных с хроническим воспалением. Нейтрофил ETs (NETs) состоят из сетки ДНК, гистоновых белков и различных грануловых белков (т.е. миелопероксидаза, эластаза и катепсина G). Другие иммунные клетки, включая макрофаги, также могут производить ЭТ; однако, в какой степени это происходит in vivo и играют ли макрофагвевные внеклеточные ловушки (МЕТ) роль в патологических механизмах, не были детально изучены. Чтобы лучше понять роль МЕТ в воспалительных патологиях, был разработан протокол для визуализации выпуска MET из первичных макрофагов человека in vitro, которые также могут быть использованы в экспериментах по иммунофлуоресценции. Это позволяет дальнейшую характеристику этих структур и их сравнение с ЭТ, выпущенными от нейтрофилов. Макрофаги, полученные из моноцитов (HMDM), производят MET при воздействии различных воспалительных стимулов после дифференциации на провоспалительный фенотип M1. Высвобождение МЕТ может быть визуализировано с помощью микроскопии с помощью зеленого флуоресцентного пятна нуклеиновой кислоты, которое является impermeant для живых клеток (например, SYTOX зеленый). Использование свежеизолированных первичных макрофагов, таких как HMDM, выгодно в моделировании воспалительных явлений in vivo, которые имеют отношение к потенциальным клиническим применениям. Этот протокол также может быть использован для изучения met релиз из человеческих моноцитов клеточных линий (например, THP-1) после дифференциации в макрофаги с phorbol myristate ацетат или другие макрофаг клеточные линии (например, морин макрофаг-как J774A.1 клеток).

Introduction

Высвобождение ETs от нейтрофилов было впервые определено как врожденный иммунный ответ, вызванный бактериальной инфекцией1. Они состоят из позвоночника ДНК, к которому связаны различные гранулированные белки с антибактериальными свойствами, втомся нейтрофил эластаза и миелопероксидаза2. Основная роль нейтрофилов ETs (NETs) заключается в захвате патогенных микроорганизмов и содействовать их ликвидации3. Однако, в дополнение к защитной роли ЭТ в иммунной защите, все большее число исследований также обнаружили роль в патогенезе болезни, особенно во время развития воспаления управляемых заболеваний (т.е. ревматоидного артрита и атеросклероз4). Высвобождение ETs может быть вызвано различными провоспалительными цитокинами, включая интерлейкин 8 (IL-8) и фактор некроза опухоли альфа (ТНФЗ)5,6, и локализованное накопление ETs может увеличить повреждение тканей и вызвать провоспалительный ответ7. Например, ETs были замешаны как играющие причинно-следственную роль в развитии атеросклероза8, содействие тромбозу9, и прогнозирование сердечно-сосудистого риска10.

В настоящее время признано, что в дополнение к нейтрофилов, другие иммунные клетки (т.е., тучные клетки, эозинофилы, и макрофаги) может также освободить ETs на воздействие микробной или про-воспалительной стимуляции11,12. Это может быть особенно важно в случае макрофагов, учитывая их ключевую роль в развитии, регуляции и разрешении хронических воспалительных заболеваний. Поэтому важно получить более глубокое понимание потенциальной взаимосвязи между выходом ET из макрофагов и развитием болезней, связанных с воспалением. Недавние исследования показали наличие МЕТ и NET в нетронутых человека атеросклеротических бляшек и организованныхтромбов 13. Аналогичным образом, METs были вовлечены в вождения травмы почек через регулирование воспалительных реакций14. Однако, в отличие от нейтрофилов, имеются ограниченные данные о механизмах формирования МЕТ из макрофагов. Недавние исследования с использованием человеческих моделей in vitro образования MET показывают некоторые различия в путях, участвующих в каждом типе клеток (т.е. в отношении отсутствия цитруллинации гистона с макрофагами)6. Тем не менее, некоторые из них показали, что NET релиз также может произойти в отсутствие гистон цитруллинации15.

Общая цель этого протокола заключается в предоставлении простого и прямого метода оценки выпуска MET в клинически релевантной модели макрофагов. Есть целый ряд различных моделей макрофагов in vitro, которые были использованы для изучения METs (т.е. линии моноцитов человека THP-1 и различных линий макрофагов murine)16. Есть некоторые ограничения, связанные с этими моделями. Например, дифференциация моноцитов THP-1 на макрофагы обычно требует грунтового шага, такого как добавление phorbol myristate acetate (PMA), который сам активирует белковую киназу C (PKC)-зависимые пути. Этот процесс, как известно, вызывает ET релиз4 и приводит к низкой базальной MET релиз из клеток THP-1. Другие исследования выявили некоторые различия в биоактивности и воспалительных реакций, установленных макрофагов in vivo по сравнению с PMA-обработанных клеток THP-117.

Аналогичным образом, поведение и воспалительные реакции различных макрофагов, похожих на минына, клеточные линии не полностью представляют спектр реакции первичных макрофагов человека18. Таким образом, с целью изучения образования макрофагов ET в клинических условиях, первичные человеческие моноциты полученных макрофагов (HMDMs), как полагают, более релевантной модели, а не моноцитные или мурин макрофаг-подобных клеточных линий.

ET релиз от M1 поляризованных HMDMs было продемонстрировано после воздействия этих клеток на ряд различных воспалительных стимулов, в том числе миелопероксидаза полученных окислительной гипохлорной кислоты (HOCl), PMA, TNF и IL-86. Описано здесь протокол для поляризации HMDMs на M1 фенотип и визуализировать последующее освобождение MET при воздействии этих воспалительных стимулов. PMA используется в качестве стимула MET релиз для облегчения сравнения с предыдущими исследованиями, которые использовали нейтрофилов. Важно отметить, что HOCl, IL-8 и TNF также используются для стимулирования выпуска MET, которые, как полагают, являются лучшими моделями воспалительной среды in vivo. Микроскопический метод визуализации ET релиз включает в себя окрашивание внеклеточной ДНК в живых клеточных культурах с помощью SYTOX зеленый, непроницаемый флуоресцентный зеленый нуклеиновой кислоты пятно, которое было успешно применено в предыдущих исследованиях нейтрофилов. Этот метод позволяет быстро и качественно оценить выпуск ET, но он не подходит в качестве отдельного метода для количественной оценки объема выпуска ET. Альтернативная методология должна использоваться, если требуется количественная оценка для сравнения масштабов выпуска ET в результате различных условий лечения или вмешательства.

Protocol

HMDM были изолированы от человеческих баффи пальто препаратов, поставляемых банком крови с этики утверждения из Сиднея местного района здравоохранения. 1. Культура HMDM Изолировать моноциты из буйных препаратов пальто, подготовленных из периферической крови здоровых …

Representative Results

Яркие изображения, показывающие морфологические изменения HMDM в ответ на стимулы для дифференциации клеток, показаны на рисунке 1. M1 поляризованные макрофаги в результате экспериментов с HMDM, подвергшимися воздействию ИФНЗ и LPS, показали удлиненную и веретенцовую форму к…

Discussion

Генерация и визуализация образования MET с использованием M1 дифференцированных HMDMs представляет собой новую модель in vitro, которая может быть полезна для исследования потенциальной патологической роли этих структур макрофагов, особенно при хронических воспалительных Условия. Он обеспе…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Вечным грантом IMPACT (IPAP201601422) и Грантом Биомедицинского проекта Фонда Ново Нордиска (NNF17OC0028990). Кроме того, Y’ признает получение австралийской премии аспирантуры от Университета Сиднея. Мы хотели бы поблагодарить г-на Пэта Пизансаракита и г-жу Морган Джонс за помощь в изоляции моноцитов и культуре тканей.

Materials

120Q broad spectrum fluorescent light source EXFO Photonic Solutions, Toronto, Canada x-cite series
Corning CellBIND Multiple Well Plate (12 wells) Sigma-Aldrich CLS3336 For cell culture
Differential Quik Stain Kit (Modified Giemsa) Polysciences Inc. 24606 Characterisation of monocytes
Hanks balanced salt solution (HBSS) Thermo-Fisher 14025050 For washing steps and HOCl treatment
Hypochlorous acid (HOCl) Sigma-Aldrich 320331 For MET stimulation
Interferon gamma Thermo-Fisher PMC4031 For M1 priming
Interleukin 4 Integrated Sciences rhil-4 For M2 priming
Interleukin 8 Miltenyl Biotec 130-093-943 For MET stimulation
L-Glutamine Sigma-Aldrich 59202C Added to culture media
Lipopolysaccharide Integrated Sciences tlrl-eblps For M1 priming
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS 1114544 For isolation of monocytes
Olympus IX71 inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan
Phorbol 12- myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 For MET stimulation
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D5652 For washing steps
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R8758 For cell culture
SYTOX green Life Technologies S7020 For MET visulaization
TH4-200 brightfield light source Olympus, Tokyo, Japan x-cite series
Tumor necrosis factor alpha Lonza 300-01A-50 For MET stimulation

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639 (2009).
  3. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  5. Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111 (2012).
  6. Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
  7. Gunzer, M. Traps and hyperinflammation – new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
  8. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
  9. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
  10. Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
  11. Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
  12. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  13. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
  14. Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
  15. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  16. Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
  17. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
  18. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  19. Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
  20. Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
  21. Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
  22. Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
  23. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Rayner, B. S., Jensen, M., Hawkins, C. L. In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages. J. Vis. Exp. (153), e60541, doi:10.3791/60541 (2019).

View Video