Summary

Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

Published: October 17, 2019
doi:

Summary

Biz antibiyotik dereplication için izojenik antibiyotiğe dirençli Escherichia coli bir kütüphane kullanan bir platform açıklar. Bakteri veya mantarlar tarafından üretilen bir antibiyotiğin kimliği, kendi direnç genini ifade eden E. coli’nin büyümesi ile ortaya çıkarılabilir. Bu platform ekonomik açıdan etkili ve zaman etkindir.

Abstract

Doğal ürün özleri yeni antibiyotikler için arama ana zorluklardan biri ortak bileşiklerin yeniden keşfi. Bu zorluğu gidermek için, bilinen bileşikleri tanımlama işlemi olan çoğaltma, ilgi örnekleri üzerinde gerçekleştirilir. Analitik ayırma ve kütle spektrometresi gibi dereplik yöntemleri zaman alıcı ve kaynak yoğun. Dereplik sürecini iyileştirmek için antibiyotik direnci platform (ARP) geliştirdik. ARP, Escherichia coli içine tek tek klonlanmış yaklaşık 100 antibiyotik direnci geninin yer aldığı bir kütüphanedir. Bu suş toplama antibiyotik dereplication için bir maliyet-etkin ve kolay yöntem de dahil olmak üzere birçok uygulama vardır. Süreç, katı ortam içeren dikdörtgen Petri kaplarının yüzeyinde antibiyotik üreten mikropların fermantasyonunu içerir ve böylece ikincil metabolitlerin orta yoluyla salgılanmasına ve yayılmasına olanak tanır. 6 günlük fermantasyon döneminden sonra mikrobiyal biyokütle çıkarılır ve petri kabına ince bir agar-bindirme ilave edilip pürüzsüz bir yüzey oluşturur ve E. coli indikatörlerinin büyümesini sağlar. ARP suşları koleksiyonumuz daha sonra antibiyotik içeren Petri kabının yüzeyine sabitlenir. Plaka bir sonraki bindirme yüzeyinde E. coli büyüme sağlamak için bir gecede kuluçka. Sadece belirli bir antibiyotiğe (veya sınıfa) direnç içeren suşlar bu yüzeyde büyür ve üretilen bileşiğin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu yöntem, bilinen antibiyotik üreticilerinin belirlenmesi nde ve yeni bileşikler üretenleri belirlemek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.

Introduction

1928 yılında penisilin keşfinden bu yana, çevresel mikroorganizmalardan elde edilen doğal ürünler antimikrobiyal bileşiklerin zengin bir kaynak olduğu kanıtlanmıştır1. Doğal ürün antibiyotiklerin yaklaşık % 80’i Streptomyces ve diğer aktinomycetes cinsinin bakterilerinden elde edilirken, geri kalan %20’si mantar türleri tarafından üretilmektedir1. Klinikte β-laktamlar, tetrasiklinler, rifamycins ve aminoglikozitler gibi en yaygın antibiyotik iskelelerinden bazıları başlangıçta mikroplardan izole edilmiştir2. Ancak, çoklu ilaca dirençli (MDR) bakterilerin yükselişi nedeniyle, antibiyotik mevcut panel tedavide daha az etkili hale gelmiştir3,4. Bunlar arasında “ESKAPE” patojenleri (yani vankomisindirençli enterokoklar ve β-laktam dirençli Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, ve Enterobacter sp.), dünya sağlık örgütü 3 gibi büyük halk sağlığı yetkilileri nin en yüksek risk ile ilişkili olduğu düşünülen bakterilerin bir alt kümesi olan3,4,5. Bu MDR patojenlerinin ortaya çıkması ve küresel yayılması yeniantibiyotikleriçin sürekli bir ihtiyaç3,4,5sonuçları . Ne yazık ki, son yirmi yılda mikrobiyal kaynaklardan yeni antibiyotiklerin keşfi giderek zor olduğunu göstermiştir6. İlaç keşfi için mevcut yaklaşımlar biyoaktif bileşiklerin yüksek iş gücü tarama dahil, doğal ürün özü kütüphaneler de dahil olmak üzere, belirli bir zamanda test edilecek özleri binlerce izin2. Ancak, bir kez antimikrobiyal aktivite tespit edilir, bir sonraki adım aktif bileşeni tanımlamak ve bilinen veya gereksiz bileşikler7içeren ortadan kaldırmak için ham özü içeriğini analiz etmektir7 ,8. Bu süreç, dereplication olarak anılacaktır, önlemek ve / veya önemli ölçüde bilinenantibiyotiklerinyeniden keşfi harcanan zamanı azaltmak için hayati önem taşımaktadır 7,9. Doğal ürün ilaç keşfi gerekli bir adım olmasına rağmen, dereplication kötü üne sahip zahmetli ve kaynak yoğun10.

Beutler ve ark. ilk dönem “dereplication” icat beri, geniş çabalar bilinen antibiyotiklerin hızlı belirlenmesi için yenilikçi stratejiler geliştirmek için yapılmıştır11,12. Bugün dereplik için kullanılan en yaygın araçlar yüksek performanslı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans tabanlı algılama yöntemleri11,13gibi analitik kromatografik sistemleri içerir. Ne yazık ki, bu yöntemlerin her biri pahalı analitik ekipman ve sofistike veri yorumu kullanımını gerektirir.

Hızla özel ekipman olmadan yapılabilir bir dereplication yöntemi geliştirmek için bir girişim, biz antibiyotik direnç platformu (ARP)10kurdu. ARP antibiyotik adjuvants keşfi için kullanılabilir, bilinen direnç mekanizmalarına karşı yeni antibiyotik bileşiklerin profilleme, ve aktinobakteriler ve diğer mikroplardan elde edilen özlerde bilinen antibiyotiklerin derepifasyonu. Burada antibiyotik derepyonu uygulamasına odaklanıyoruz. ARP en sık yeniden keşfedilen antibiyotiklere karşı etkili bireysel direnç genleri ifade izojenik Escherichia coli suşları bir kütüphane kullanır14,15. E. coli kütüphanesi ikincil bir metabolit üreten organizmanın varlığında büyüdüğünde, bileşiğin kimliği, ilişkili dirençgeniniifade eden E. coli suşlarının büyümesi ile ortaya çıkarılabilir 10 . ARP ilk rapor edildiğinde, kütüphane 16 antibiyotik sınıfına direnç kazandıran >40 genden oluşuyordu. Orijinal dereplication şablonu derepifasyon işlemi sırasında antibiyotik alt sınıf ile ilgili bilgi sağlamak için antibiyotik sınıfı başına direnç genlerinin bir alt kümesini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır. Bugün, ARP 18 antibiyotik sınıflarına direnç veren >90 genlerden oluşmaktadır. Direnç genleri bizim geniş koleksiyonu kullanarak, ikincil bir dereplik şablonu geliştirilmiştir ve minimal antibiyotik direnç platformu (MARP) olarak bilinir. Bu şablon, gen artıklığını ortadan kaldırmak ve sadece dereplicated metabolitin ilişkili olduğu genel antibiyotik sınıfı ile ilgili bilgi sağlamak için oluşturuldu. Ayrıca, MARP şablonu hem wildtype ve E. coli BW25113(E. coli BW25133ΔB ΔBΔtolC)bir hiperpermeable / efflux eksik suşu sahip, Sadece ARP orijinal cisimleşme ile karşılaştırıldığında, hiperpermeable suş kullanır. Bu benzersiz yönü dereplik sırasında ek fenotipler oluşturur, Gram-negatif bakterilerin dış membran çapraz bir bileşikler yeteneği gösteren. Burada, ARP ve/veya MARP ile çoğaltma yaparken izlenecek sağlam bir protokolü açıklar, izlenecek en kritik adımları vurgular ve çeşitli olası sonuçları tartışırız.

Protocol

1. E. coli Kütüphanesi Gliserol Stoklarının Hazırlanması (Agar Eğimlerinden) ARP/MARP E. coli suşlarını lysogeny suyu (LB) agar eğimlerinden LB agar ve uygun seçilebilir marker içeren Petri kaplarına doğru çizgileyin(Tablo 1). Tek bir koloni ile uygun seçilebilir marker içeren LB 3 mL aşılayarak E. coli suşlarının her biri için kültürler hazırlayın. Havalandırma (250 rpm) ile 37 °C’de bir gecede büyüyün. 800 μL kü…

Representative Results

Aşağıdaki sonuçlar, antibiyotik üreten bir ilgi suşlarının arp ve/veya MARP kullanılarak çoğaltılması yla elde edilebildi. ARP/MARP dereplik iş akışının diyagramı Şekil 1’degösterilmiştir ve kütüphane plaka haritaları Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2’degösterilmiştir. Şekil 2, çevresel ekstre WAC 8921’in kloramfenikol üreticisi olarak tanımlandığı pozitif bir dereplik sonuc…

Discussion

Yukarıda açıklanan protokol, hem yeni antimikrobiyal bileşiklerin keşfine hem de aktivitelerini kurtarmak için mevcut antibiyotiklerle birlikte kullanılabilecek adjuvants’a uygulanabilir. Platform direnç mekanizmaları ve onların cognate antibiyotikyüksek substrat özgüllüğü yararlanır, ham doğal ürün özleri içinde bileşikleri dereplicate için. Dereplication plakaları için gerekli süre uzun olmasına rağmen (~2 hafta), derepyon işleminin kendisi tek bir gecelik kuluçka döneminden sonra tamaml…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wright laboratuvarında ARP/MARP ile ilgili araştırmalar Ontario Araştırma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri hibesi (FRN-148463) tarafından desteklendi. Sommer Chou’ya ARP kütüphanesinin genişletilmesi ve organizasyonuna yardımcı olduğu için teşekkür etmek istiyoruz.

Materials

Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

References

  1. Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
  2. Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
  3. Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
  4. Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
  5. Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
  6. Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
  7. Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
  8. Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
  9. Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
  10. Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
  11. Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  12. Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
  13. Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
  14. Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
  15. Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).

Play Video

Cite This Article
Zubyk, H. L., Cox, G., Wright, G. D. Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform. J. Vis. Exp. (152), e60536, doi:10.3791/60536 (2019).

View Video