Summary

אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה

Published: October 17, 2019
doi:

Summary

אנו מתארים פלטפורמה כי מנצל את הספרייה של עמידות לאנטיביוטיקה איזוגניים לdereplication של אנטיביוטיקה . הזהות של אנטיביוטיקה המיוצר על ידי חיידקים או פטריות ניתן להסיק על ידי הצמיחה של E. coli ביטוי ההתנגדות המתאים שלה הגן. פלטפורמה זו יעילה כלכלית וחסכונית בזמן.

Abstract

אחד האתגרים העיקריים בחיפוש אחר אנטיביוטיקה חדשה מתמציות המוצר הטבעי הוא גילוי מחדש של תרכובות נפוצות. כדי להתמודד עם האתגר הזה, dereplication, שהוא תהליך של זיהוי תרכובות ידועות, מבוצע על דגימות של עניין. שיטות לdereplication כגון הפרדה אנליטית ולאחריה ספקטרומטר מסה הינן צורכות זמן רב ועתירות משאבים. כדי לשפר את תהליך dereplication, פיתחנו את פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP). ARP היא ספריה של כ 100 גנים עמידות לאנטיביוטיקה ששוכפל בנפרד לתוך es, coli. אוסף זה הנבג יש יישומים רבים, כולל שיטה חסכונית ונתיישב עבור אנטיביוטיקה dereplication. התהליך כולל תסיסה של חיידקים המייצרים אנטיביוטיקה על פני השטח של מנות פטרי מלבני המכילות בינונית יציבה, ובכך מאפשר הפרשה ודיפוזיה של מטבוליטים משני דרך המדיום. לאחר תקופת תסיסה של 6 ימים, מסירים את ביומסה החיידקים, ומוסיפים לצלחת הפטרי דק שכבת-על כדי ליצור משטח חלק ולאפשר את התפתחותם של זנים מחוון ה-coli . האוסף שלנו של זני ARP מוצמד לאחר מכן על פני השטח של צלחת פטרי המכילה את האנטיביוטיקה. הצלחת היא הדגירה הבאה לילה כדי לאפשר צמיחה E. coli על פני השטח של כיסוי. רק זנים המכילים התנגדות אנטיביוטי ספציפי (או הכיתה) לגדול על פני השטח הזה מאפשר זיהוי מהיר של התרכובת המיוצר. שיטה זו בוצעה בהצלחה לזיהוי יצרנים של אנטיביוטיקה ידועה וכאמצעי לזיהוי אלה המייצרים תרכובות הרומן.

Introduction

מאז גילוי של פניצילין ב 1928, מוצרים טבעיים נגזר מיקרואורגניזמים סביבתיים הוכיחו להיות מקור עשיר של תרכובות מיקרוביאלית1. כ 80% של אנטיביוטיקה המוצר הטבעי נגזרות חיידקים של סוג Streptomyces ואקטיטיטים אחרים, בעוד 20% הנותרים מופק על ידי מינים פטרייתי1. כמה מהפיגומים הנפוצים ביותר לאנטיביוטיקה המשמשים במרפאה כגון β-lactams, טטרציקווים, rifamycins, ו הקוגליניים, היו מבודדים במקור מחיידקים2. עם זאת, בשל עלייתה של עמיד בפני סמים (mdr) חיידקים, פאנל הנוכחי שלנו של אנטיביוטיקה הפך פחות יעיל בטיפול3,4. אלה כוללים את “ESKAPE” פתוגנים (כלומר, vancomycin עמידים בפני בידור ו β-lactam עמידים בפני לקטקוקוס, klebsiella דלקת ריאות, הפסאודומונס aeruginosa, acineטבק הביטוחהעצמי, ו Enterobacter sp.), המהווה תת-ערכה של חיידקים, הנחשבים לבעלי הסיכון הגבוה ביותר על-ידי מספר רשויות בריאות הציבור הגדולות כגון ארגון הבריאות העולמי3,4,5. הופעתה הגלובלית התפשטות של אלה mdr פתוגנים תוצאות הצורך קבוע עבור אנטיביוטיקה הרומן3,4,5. למרבה הצער, שני העשורים האחרונים הוכיחו כי גילוי של אנטיביוטיקה הרומן ממקורות מיקרוביאלית הוא קשה יותר ויותר6. הגישות הנוכחיות לגילוי הסמים כוללות הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות אקטיביים, כולל ספריות מוצר טבעי לחלץ, המאפשר אלפי תמציות להיבדק בזמן נתון2. עם זאת, לאחר מזוהה פעילות מיקרוביאלית, השלב הבא הוא לנתח את התוכן של התמצית גולמי כדי לזהות את הרכיב הפעיל ולסלק את אלה המכילים תרכובות ידועות או יתירים7,8. תהליך זה, המכונה dereplication, חיוני כדי למנוע ו/או להקטין באופן משמעותי את הזמן המושקע בגילוי מחדש של אנטיביוטיקה ידועה7,9. למרות שצעד הכרחי בגילוי הסמים הטבעי של המוצר, dereplication הוא מפרך לשמצה ואינטנסיבי משאבים10.

מאז beutler et al. לראשונה נטבע את המונח “dereplication”, מאמצים נרחבים נעשו כדי לפתח אסטרטגיות חדשניות לזיהוי מהיר של אנטיביוטיקה ידועה11,12. כיום הכלים השכיחים ביותר המשמשים לdereplication כוללים מערכות כרומטוגרפיות אנליטיות כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, ספקטרומטר מסה, ושיטות זיהוי מבוססות תהודה מגנטית גרעינית11,13. למרבה הצער, כל אחת מהשיטות הללו מחייבת שימוש בציוד אנליטי יקר ובפרשנות נתונים מתוחכמת.

בניסיון לפתח שיטה dereplication שניתן לבצע במהירות ללא ציוד מיוחד, הקמנו פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה (ARP)10. ARP יכול לשמש לגילוי של שדון אנטיביוטי, הפרופיל של תרכובות אנטיביוטיות חדשות נגד מנגנוני ההתנגדות ידוע, ואת dereplication של אנטיביוטיקה ידועים בתמציות הנגזרות של אקאובקטריה וחיידקים אחרים. כאן, אנו מתמקדים ביישום שלה dereplication אנטיביוטי. ARP מנצל את הספריה של איזוגניים es, המאשכיה זנים המבטא גנים בודדים התנגדות כי הם יעילים נגד אנטיביוטיקה הנפוץ ביותר מחדש גילו14,15. כאשר הספרייה E. coli גדל בנוכחות של אורגניזם משני מייצר מטבוליזם, את הזהות של המתחם ניתן להסיק על ידי הצמיחה של החיידק של E. coli המבטאים הגן הקשור שלה התנגדות10. כאשר ה-ARP דווח לראשונה, הספריה כללה > 40 גנים הענקת עמידות ל -16 שיעורי אנטיביוטי. תבנית הdereplication המקורית תוכננה להקיף תת-ערכה של גנים ההתנגדות לכל מחלקה לאנטיביוטיקה כדי לספק מידע לגבי מחלקת משנה אנטיביוטי בתהליך dereplication. כיום, ה-ARP מורכב מ> 90 גנים המקנים עמידות ל -18 שיעורים אנטיביוטיים. באמצעות האוסף הנרחב שלנו של גנים ההתנגדות, תבנית dereplication משנית פותחה והוא ידוע כפלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה מינימלית (MARP). תבנית זו נוצרה כדי למנוע יתירות גנטית כדי פשוט לספק מידע לגבי המעמד האנטיביוטי הכללי כי מטבוליט dereplicated lite קשורה. בנוסף, התבנית MARP מחזיקה הן מסוג wildtype ואת המתח היתר/לקוי של E. coli BW25113 (e. Coli BW25113 ΔbambΔtolc), לעומת הגלגול המקורי של ה-ARP, אשר רק מנצל את המתח היפרחדיר. היבט ייחודי זה יוצר פנוטיפים נוספים במהלך dereplication, המציין את היכולת תרכובות לחצות את הקרום החיצוני של חיידקים גראם שליליים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חזק להיות שלאחר מכן כאשר מקבל הפחתה עם ה-ARP ו/או MARP, להדגיש את הצעדים הקריטיים ביותר לעקוב, ולדון בתוצאות אפשריות שונות.

Protocol

1. הכנת הספריה E. coli מניות גליצרול (מאת אגר סלטס) פס החיידק ARP/MARP E. coli מציר lysogeny קימוט (LB) אגר הסלטים על מנות פטרי המכילות LB אגר ואת סמן לבחירה המתאים (שולחן 1). הכינו תרבויות עבור כל אחד מזני E. coli על ידי הנעם 3 מ ל של LB המכיל את סמן לבחירה המתאים עם מושבה אחת. לגדול …

Representative Results

התוצאות הבאות הושגו כאשר אוסף של זנים של מdereplicated לאנטיביוטיקה הפקת הריבית היו באמצעות ה-ARP ו/או MARP. דיאגרמה של זרימת העבודה dereplication ARP/MARP מתוארת באיור 1, ומפות לוחית הספרייה מוצגות באיור המשלים 1 ובאיור 2. איור 2 מדגים תוצאה חיו…

Discussion

הפרוטוקול המתואר לעיל יכול להיות מיושם הן גילוי של תרכובות מיקרוביאלית הרומן ושדון שניתן להשתמש בשילוב עם אנטיביוטיקה קיימים כדי להציל את פעילותם. פלטפורמת מנצל את הפלטפורמות הגבוהות של המצע של מנגנוני התנגדות ואנטיביוטיקה קנצוני שלהם, לתרכובות dereplicate בתוך תמציות טבעי גולמי מוצר. למרות …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר במעבדת רייט בנוגע ל-ARP/MARP נתמך על ידי קרן מחקר אונטריו ומכונים קנדיים של מלגת מחקר בריאות (FRN-148463). אנו רוצים להכיר בסומר צ’ו על הסיוע בהרחבת ובארגון של ספריית ה-ARP.

Materials

Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

References

  1. Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
  2. Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
  3. Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
  4. Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
  5. Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
  6. Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
  7. Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
  8. Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
  9. Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
  10. Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
  11. Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  12. Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
  13. Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
  14. Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
  15. Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).

Play Video

Cite This Article
Zubyk, H. L., Cox, G., Wright, G. D. Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform. J. Vis. Exp. (152), e60536, doi:10.3791/60536 (2019).

View Video