Summary

Desreferência antibiótica usando a plataforma de resistência a antibióticos

Published: October 17, 2019
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Summary

Nós descrevemos uma plataforma que utilize uma biblioteca de Escherichia coli resistente antibiótico isogênicos para o desreplicação dos antibióticos. A identidade de um antibiótico produzido por bactérias ou fungos pode ser deduzada pelo crescimento de E. coli expressando seu respectivo gene de resistência. Esta plataforma é economicamente eficaz e tempo-eficiente.

Abstract

Um dos principais desafios na busca de novos antibióticos a partir de extratos de produtos naturais é a re-descoberta de compostos comuns. Para abordar esse desafio, a dereplicação, que é o processo de identificação de compostos conhecidos, é realizada em amostras de interesse. Os métodos de desreferência, como a separação analítica seguida por espectrometria de massas, são demorados e com uso intensivo de recursos. Para melhorar o processo de dereplicação, desenvolvemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP). O ARP é uma biblioteca de aproximadamente 100 genes da resistência antibiótica que foram clonados individualmente em Escherichia coli. Esta coleção de estirpe tem muitas aplicações, incluindo um método rentável e facile para a dereplicação de antibióticos. O processo envolve a fermentação de micróbios de produção de antibióticos na superfície de placas de Petri retangulares contendo meio sólido, permitindo assim a secreção e difusão de metabólitos secundários através do meio. Após um período de fermentação de 6 dias, a biomassa microbiana é removida e uma fina sobreposição de agar é adicionada à placa de Petri para criar uma superfície lisa e permitir o crescimento das cepas do indicador e. coli . Nossa coleção de cepas de ARP é fixada na superfície do prato de Petri contendo antibióticos. A placa é incubada em seguida durante a noite para permitir o crescimento de E. coli na superfície da sobreposição. Apenas cepas que contenham resistência a um antibiótico específico (ou classe) crescem nesta superfície, possibilitando a rápida identificação do composto produzido. Este método tem sido usado com sucesso para a identificação de produtores de antibióticos conhecidos e como um meio para identificar aqueles que produzem novos compostos.

Introduction

Desde a descoberta da penicilina em 1928, os produtos naturais derivados de microrganismos ambientais provaram ser uma fonte rica de compostos antimicrobianos1. Aproximadamente 80% dos antibióticos do produto natural são derivados de bactérias do gênero Streptomyces e outros Actinomycetes, enquanto os 20% restantes são produzidos por espécies fúngicas1. Alguns dos andaimes antibióticos mais comuns utilizados na clínica, como os β-lactams, tetraciclinas, rifamicinas e aminoglicosídeos, foram originalmente isolados de micróbios2. No entanto, devido ao surgimento de bactérias multirresistentes (MDR), nosso atual painel de antibióticos tornou-se menos eficaz no tratamento3,4. Estes incluem os patógenos “ESKAPE” (i.e., enterococos resistentes à vancomicina e Staphylococcus aureusresistentes a β-lactâmicos, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniie Enterobacter SP.), que são um subconjunto de bactérias consideradas associadas ao maior risco por um número de grandes autoridades de saúde pública, como a Organização Mundial da saúde3,4,5. O surgimento e a disseminação global desses patógenos do MDR resultam em uma necessidade constante de novos antibióticos3,4,5. Lamentavelmente, as duas últimas décadas demonstraram que a descoberta de novos antibióticos a partir de fontes microbianas é cada vez mais difícil6. As abordagens atuais para a descoberta de drogas incluem a triagem de alto débito de compostos bioativos, incluindo bibliotecas de extração de produtos naturais, permitindo que milhares de extratos sejam testados em um determinado momento2. No entanto, uma vez detectada a atividade antimicrobiana, o próximo passo é analisar o conteúdo do extrato bruto para identificar o componente ativo e eliminar aqueles que contenham compostos conhecidos ou redundantes7,8. Este processo, referido como dereplication, é vital para prevenir e/ou reduzir significativamente o tempo gasto na redescoberta de antibióticos conhecidos7,9. Embora um passo necessário na descoberta de medicamentos de produto natural, a desreferência é notoriamente trabalhosa e intensiva de recursos10.

Desde que Beutler et al. primeiro cunhou o termo “dereplicação”, esforços extensivos têm sido feitos para desenvolver estratégias inovadoras para a rápida identificação de antibióticos conhecidos11,12. Hoje, as ferramentas mais comuns utilizadas para a dereplicação incluem sistemas cromatográficosanalíticos, comocromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e métodos de detecção baseados em ressonância magnética nuclear11,13. Infelizmente, cada um desses métodos requer o uso de equipamentos analíticos caros e interpretação de dados sofisticados.

Na tentativa de desenvolver um método de desreferência que pode ser realizado rapidamente sem equipamento especializado, estabelecemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP)10. O ARP pode ser usado para a descoberta de adjuvantes antibióticos, o perfilamento de novos compostos antibióticos contra mecanismos de resistência conhecidos, e a desreferência de antibióticos conhecidos em extratos derivados de actinobactérias e outros micróbios. Aqui, nós nos concentramos em sua aplicação na dereplicação de antibióticos. O ARP utiliza uma biblioteca de cepas isogênicas de Escherichia coli expressando genes de resistência individuais que são eficazes contra os antibióticos mais comumente redescobertos14,15. Quando a biblioteca de e. coli é cultivada na presença de um organismo produtor de metabolito secundário, a identidade do composto pode ser deduzada pelo crescimento de cepas de e. coli que expressam seu gene de resistência associado10. Quando o ARP foi relatado pela primeira vez, a biblioteca consistiu em > 40 genes conferindo resistência a 16 classes de antibióticos. O modelo de dereplicação original foi projetado para abranger um subconjunto de genes de resistência por classe antibiótica para fornecer informações sobre subclasse antibiótica durante o processo de desreferência. Hoje, o ARP é compreendido de > 90 genes que conferem a resistência a 18 classes antibióticas. Usando nossa extensa coleção de genes de resistência, um modelo de dereplicação secundária foi desenvolvido e é conhecido como a plataforma mínima de resistência a antibióticos (MARP). Este modelo foi criado para eliminar a redundância genética e simplesmente fornecer informações sobre a classe geral de antibióticos que um metabolito dereplicated está relacionado. Adicionalmente, o modelo de MARP possui o tipo selvagem e uma tensão deficiente hyperpermeable/efflux de e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δBAMBδTolc), comparado à encarnação original do ARP, que somente utiliza a estirpe hiperpermeável. Este aspecto único cria fenótipos adicionais durante a dereplicação, indicando uma capacidade de compostos para atravessar a membrana externa de bactérias Gram-negativas. Aqui, nós descrevemos um protocolo robusto a ser seguido quando dereplicating com o ARP e/ou o MARP, realça as etapas as mais críticas a ser seguidas, e discute os vários resultados possíveis.

Protocol

1. preparação de E. coli biblioteca de estoques de glicerol (a partir de agar Slants) Raia as cepas de ARP/MARP e. coli de inclinações de agar de caldo de lisogenia (lb) em placas de Petri contendo Agar lb e o marcador selecionável apropriado (tabela 1). Prepare culturas para cada uma das cepas de E. coli inoculando 3 ml de lb contendo o marcador selecionável apropriado com uma única colônia. Cresça durante a noite em 37 ° c com aeração (250 rpm)…

Representative Results

Os seguintes resultados foram obtidos quando uma coleta de cepas produtoras de antibióticos de interesse foi desreferência utilizando o ARP e/ou MARP. Um diagrama do fluxo de trabalho de dereplicação ARP/MARP é representado na Figura 1, e os mapas da placa de biblioteca são mostrados na figura 1 suplementar e na Figura 2 suplementar. A Figura 2 demonstra um resultado de dereplicação positiva e…

Discussion

O protocolo descrito acima pode ser aplicado à descoberta de novos compostos antimicrobianos e adjuvantes que podem ser usados em conjunto com os antibióticos existentes para resgatar sua atividade. A plataforma aproveita a especificidade elevada da carcaça de mecanismos da resistência e de seus antibióticos cognato, aos compostos do dereplicate dentro dos extratos naturais crus do produto. Embora o tempo necessário para que as placas de desreferência sejam preparadas seja longa (~ 2 semanas), o processo de derepl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A pesquisa no laboratório de Wright que pertence ao ARP/MARP foi apoiada pelo fundo da pesquisa de Ontário e pelos institutos canadenses da concessão da pesquisa da saúde (FRN-148463). Gostaríamos de reconhecer Sommer Chou para ajudar na expansão e organização da biblioteca ARP.

Materials

Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

References

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Cite This Article
Zubyk, H. L., Cox, G., Wright, G. D. Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform. J. Vis. Exp. (152), e60536, doi:10.3791/60536 (2019).

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