Summary

Антибиотическая дерепликация с использованием платформы устойчивости к антибиотикам

Published: October 17, 2019
doi:

Summary

Мы описываем платформу, которая использует библиотеку изогенных устойчивых к антибиотикам Escherichia coli для дерепликации антибиотиков. Идентичность антибиотика, вырабатываемого бактериями или грибами, может быть выведена ростом кишечной палочки, выражающей свой ген резистентности. Эта платформа является экономически эффективной и действенной по времени.

Abstract

Одной из основных проблем в поиске новых антибиотиков из экстрактов натуральных продуктов является повторное открытие общих соединений. Для решения этой проблемы, dereplication, который является процесс идентификации известных соединений, осуществляется на образцах, представляющих интерес. Методы дерепликации, такие как аналитическое разделение с последующей масс-спектрометрией, отнимают много времени и ресурсоемки. Для улучшения процесса дерепликации мы разработали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP). ARP представляет собой библиотеку из примерно 100 генов устойчивости к антибиотикам, которые были индивидуально клонированы в кишечную палочку. Эта коллекция штаммов имеет много применений, в том числе экономически эффективный и поверхностный метод для антибиотиков dereplication. Этот процесс включает в себя брожение антибиотикопроизводящих микробов на поверхности прямоугольных блюд Петри, содержащих твердую среду, тем самым позволяя секрецию и диффузию вторичных метаболитов через среду. После 6-дневного периода брожения микробная биомасса удаляется, а в блюдо Петри добавляется тонкая агар-накладка, чтобы создать гладкую поверхность и обеспечить рост штаммов индикатора кишечной палочки. Наша коллекция штаммов ARP затем прикрепляется на поверхность антибиотикосодержащей чашки Петри. Пластина следующий инкубируется на ночь, чтобы обеспечить рост кишечной палочки на поверхности наложения. Только штаммы, содержащие устойчивость к конкретному антибиотику (или классу), растут на этой поверхности, что позволяет быстро идентифицировать произведенное соединение. Этот метод успешно используется для выявления производителей известных антибиотиков и в качестве средства для выявления лиц, производящих новые соединения.

Introduction

С момента открытия пенициллина в 1928 году натуральные продукты, полученные из экологических микроорганизмов, оказались богатым источником противомикробных соединений1. Приблизительно 80% антибиотиков натурального продукта получены из бактерий рода Streptomyces и других актиномицетов, в то время как остальные 20% производится грибковых видов1. Некоторые из наиболее распространенных антибиотиков леса, используемые в клинике, такие как к-лактамы, тетрациклины, рифамицины, и аминогликозиды, были первоначально изолированы от микробов2. Однако, в связи с ростом бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), наша текущая панель антибиотиков стала менее эффективной в лечении3,4. К ним относятся патогенные микроорганизмы “ESKAPE” (т.е. ванкомицин-устойчивые энтерококки и лактам-резистентный золотистый стафилококк, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacter sp.), которые являются подмножеством бактерий, которые считаются связанными с самым высоким риском ряда крупных органов общественного здравоохранения, таких как Всемирная организация здравоохранения3,4,5. Появление и глобальное распространение этих патогенов МЛУ приводит к постоянной потребности в новых антибиотиках3,4,5. К сожалению, последние два десятилетия показали, что открытие новых антибиотиков из микробных источников становится все труднее6. Текущие подходы к открытию наркотиков включают высокопроизводительный скрининг биологически активных соединений, включая библиотеки экстракта природного продукта, что позволяет проверить тысячи экстрактов в данный момент2. Однако, как только антимикробная активность обнаружена, следующим шагом является анализ содержимого сырого экстракта для выявления активного компонента и устранения тех, которые содержат известные или избыточные соединения7,8. Этот процесс, называемый дерепликцией, имеет жизненно важное значение для предотвращения и / или значительно сократить время, затрачиваемые на повторное открытие известных антибиотиков7,9. Хотя необходимый шаг в открытии натуральных продуктов наркотиков, dereplication, как известно, трудоемким и ресурсоемким10.

С тех пор как Beutler et al. впервые придумалтермин “дерепликация”, были предприняты активные усилия по разработке инновационных стратегий для быстрого выявления известных антибиотиков11,12. Сегодня наиболее распространенными инструментами, используемыми для дерепликации, являются аналитические хроматографические системы, такие как высокопроизводительная жидкая хроматография, масс-спектрометрия и методы обнаружения ядерного магнитного резонанса11,13. К сожалению, каждый из этих методов требует использования дорогостоящего аналитического оборудования и сложной интерпретации данных.

В попытке разработать метод дерепликации, который может быть быстро выполнен без специализированного оборудования, мы создали платформу устойчивости к антибиотикам (ARP)10. ARP может быть использован для открытия антибиотиков адъювантов, профилирование новых соединений антибиотиков против известных механизмов устойчивости, и dereplication известных антибиотиков в экстрактах, полученных из актинобактерий и других микробов. Здесь мы сосредоточимся на его применении в антибиотико-дерепликации. ARP использует библиотеку изогенных штаммов Escherichia coli, выражающих индивидуальные гены резистентности, которые эффективны против наиболее часто открываемых антибиотиков14,15. Когда библиотека кишечной палочки выращивается в присутствии вторичного метаболита-производящего организма, идентичность соединения может быть выведена ростом штаммов кишечной палочки, которые выражают связанный с ним ген резистентности10. Когда ARP впервые было сообщено, библиотека состояла из генов, придающих устойчивость к 16 классам антибиотиков. Оригинальный шаблон дерепликации был разработан, чтобы охватить подмножество генов устойчивости в классе антибиотиков, чтобы предоставить информацию о подклассе антибиотиков в процессе дерепликации. Сегодня, ARP состоит из генов, которые дают устойчивость к 18 классам антибиотиков. Используя нашу обширную коллекцию генов резистентности, был разработан вторичный шаблон дерепликации, который известен как платформа минимальной устойчивости к антибиотикам (MARP). Этот шаблон был создан для устранения избыточности генов и просто предоставить информацию об общем классе антибиотиков, с которым связан дереплицированный метаболит. Кроме того, шаблон MARP обладает как диким типом, так и гиперпроницаемым/дефицитным штаммом E. coli BW25113 (E. coli BW25113 ,bamB использует гиперпроницаемый штамм. Этот уникальный аспект создает дополнительные фенотипы во время дерепликации, указывая на способность соединений пересекать внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий. Здесь мы описываем надежный протокол, которым следует следовать при дерепликации либо с ARP и/или MARP, очерчив наиболее важные шаги, которым следует следовать, и обсудим различные возможные результаты.

Protocol

1. Подготовка E. coli Библиотека Глицерол запасов (от Агар Сланц) Полоса ARP / MARP E. coli штаммов из лисогенного бульона (LB) агар наклоняется на Петри блюда, содержащие LB агар и соответствующий выбираемый маркер (Таблица 1). Подготовка культур для каждого из штаммов ?…

Representative Results

Следующие результаты были получены, когда коллекция антибиотикообразующих штаммов, представляющих интерес, была дереплицирована с помощью ARP и/или MARP. Диаграмма рабочего процесса dereplication ARP/MARP изображена на рисунке 1,а библиотечные карты пластины показан…

Discussion

Описанный выше протокол может применяться как к открытию новых противомикробных соединений, так и к адъювантам, которые могут быть использованы в сочетании с существующими антибиотиками для спасения их деятельности. Платформа использует высокую специфичность субстрата механизмов р?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования в лаборатории Райта, относящиеся к ARP/MARP, были поддержаны Исследовательским фондом Онтарио и канадскими институтами исследований в области здравоохранения (FRN-148463). Мы хотели бы поблагодарить Соммера Чоу за содействие в расширении и организации библиотеки ARP.

Materials

Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

References

  1. Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R., Dhanasekaran, D., Jiang, Y. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. Basics and Biotechnological Applications. , (2016).
  2. Thaker, M. N., et al. Identifying producers of antibacterial compounds by screening for antibiotic resistance. Nature Biotechnology. 31, 922-927 (2013).
  3. Gajdács, M. The Concept of an Ideal Antibiotic: Implications for Drug Design. Molecules. 24, 892 (2019).
  4. Boucher, H. W., et al. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 48, 1-12 (2009).
  5. Gajdács, M. The Continuing Threat of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antibiotics. 8, 52 (2019).
  6. Gaudêncio, S. P., Pereira, F. Dereplication: Racing to speed up the natural products discovery process. Natural Product Reports. 32, 779-810 (2015).
  7. Ito, T., Masubuchi, M. Dereplication of microbial extracts and related analytical technologies. The Journal of Antibiotics (Tokyo). 67, 353-360 (2014).
  8. Van Middlesworth, F., Cannell, R. J. Dereplication and Partial Identification of Natural Products. Methods in Biotechnology. , 279-327 (2008).
  9. Tawfike, A. F., Viegelmann, C., Edrada-Ebel, R., Roessner, U., Dias, D. A. Metabolomics and Dereplication Strategies in Natural Products. Metabolomics Tools for Natural Product Discovery: Methods and Protocols. , 227-244 (2013).
  10. Cox, G., et al. A Common Platform for Antibiotic Dereplication and Adjuvant Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 98-109 (2017).
  11. Hubert, J., Nuzillard, J. M., Renault, J. H. Dereplication strategies in natural product research: How many tools and methodologies behind the same concept. Phytochemistry Reviews. 16, 55-95 (2017).
  12. Beutler, J. Dereplication of phorbol bioactives: Lyngbya majuscula and Croton cuneatus. Journal of Natural Products. 53, 867-874 (1990).
  13. Mohimani, H., et al. Dereplication of microbial metabolites through database search of mass spectra. Nature Communications. 9, 1-12 (2018).
  14. Baltz, R. H. Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).
  15. Baltz, R. H. Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall. Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).

Play Video

Cite This Article
Zubyk, H. L., Cox, G., Wright, G. D. Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform. J. Vis. Exp. (152), e60536, doi:10.3791/60536 (2019).

View Video