Summary

Desreplicación de antibióticos utilizando la plataforma de resistencia a antibióticos

Published: October 17, 2019
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Summary

Describimos una plataforma que utiliza una biblioteca de Escherichia coli isogénica resistente a antibióticos para la dereplicación de antibióticos. La identidad de un antibiótico producido por bacterias u hongos puede deducirse por el crecimiento de E. coli expresando su respectivo gen de resistencia. Esta plataforma es económicamente eficaz y eficiente en el tiempo.

Abstract

Uno de los principales desafíos en la búsqueda de nuevos antibióticos a partir de extractos de productos naturales es el redescubrimiento de compuestos comunes. Para hacer frente a este desafío, la desreplicación, que es el proceso de identificación de compuestos conocidos, se realiza en muestras de interés. Los métodos de desreplicación, como la separación analítica, seguido de la espectrometría de masas, consumen mucho tiempo y consumen muchos recursos. Para mejorar el proceso de desreplicación, hemos desarrollado la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP). La ARP es una biblioteca de aproximadamente 100 genes de resistencia a antibióticos que han sido clonados individualmente en Escherichia coli. Esta colección de cepas tiene muchas aplicaciones, incluyendo un método rentable y fácil para la dereplicación de antibióticos. El proceso consiste en la fermentación de microbios productores de antibióticos en la superficie de platos rectangulares de Petri que contienen medio sólido, permitiendo así la secreción y difusión de metabolitos secundarios a través del medio. Después de un período de fermentación de 6 días, se elimina la biomasa microbiana, y se añade una fina superposición de agar a la placa Petri para crear una superficie lisa y permitir el crecimiento de las cepas indicadoras de E. coli. Nuestra colección de cepas ARP se fija a la superficie de la placa Petri que contiene antibióticos. La placa se incuba a continuación durante la noche para permitir el crecimiento de E. coli en la superficie de la superposición. Sólo crecen en esta superficie cepas que contienen resistencia a un antibiótico específico (o clase) permitiendo una rápida identificación del compuesto producido. Este método se ha utilizado con éxito para la identificación de los productores de antibióticos conocidos y como un medio para identificar aquellos que producen nuevos compuestos.

Introduction

Desde el descubrimiento de la penicilina en 1928, los productos naturales derivados de microorganismos ambientales han demostrado ser una rica fuente de compuestos antimicrobianos1. Aproximadamente el 80% de los antibióticos de productos naturales se derivan de bacterias del género Streptomyces y otros actinomycetes, mientras que el 20% restante es producido por las especies de hongos1. Algunos de los andamios antibiótico más comunes utilizados en la clínica, tales como los lactams, las tetraciclinas, las rifamicinas y los aminoglucósidos, fueron originalmente aislados de los microbios2. Sin embargo, debido al aumento de las bacterias multirresistentes (MDR), nuestro panel actual de antibióticos se ha vuelto menos eficaz en el tratamiento3,4. Estos incluyen los patógenos “ESKAPE” (es decir, enterococos resistentes a la vancomicina y Staphylococcus aureusresistentes a la lactam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii,y Enterobacter sp.), que son un subconjunto de bacterias consideradas asociadas al mayor riesgo por una serie de importantes autoridades de salud pública como la Organización Mundial de la Salud3,4,5. La aparición y propagación global de estos patógenos MDR da lugar a una necesidad constante de nuevos antibióticos3,4,5. Lamentablemente, las últimas dos décadas han demostrado que el descubrimiento de nuevos antibióticos de fuentes microbianas es cada vez más difícil6. Los enfoques actuales para el descubrimiento de fármacos incluyen el cribado de alto rendimiento de compuestos bioactivos, incluidas las bibliotecas de extractos de productos naturales, lo que permite probar miles de extractos en un momento dado2. Sin embargo, una vez detectada la actividad antimicrobiana, el siguiente paso es analizar el contenido del extracto crudo para identificar el componente activo y eliminar aquellos que contienen compuestos conocidos o redundantes7,8. Este proceso, conocido como desreplicación, es vital para prevenir y/o reducir significativamente el tiempo dedicado al redescubrimiento de antibióticos conocidos7,9. Aunque es un paso necesario en el descubrimiento de fármacos de productos naturales, la dereplicación es notoriamente laboriosa y requiere muchos recursos10.

Desde que Beutler y otros acuñaron por primera vez el término “desreplicación”, se han realizado amplios esfuerzos para desarrollar estrategias innovadoras para la rápida identificación de antibióticos conocidos11,12. Hoy en día, las herramientas más comunes utilizadas para la desreplicación incluyen sistemas cromatográficos analíticos como cromatografía líquida de alto rendimiento, espectrometría de masas y métodos de detección basados en resonancia magnética nuclear11,13. Desafortunadamente, cada uno de estos métodos requiere el uso de costosos equipos analíticos y una sofisticada interpretación de datos.

En un intento de desarrollar un método de desreplicación que se puede realizar rápidamente sin equipo especializado, establecimos la plataforma de resistencia a antibióticos (ARP)10. El ARP se puede utilizar para el descubrimiento de adyuvantes antibióticos, la elaboración de perfiles de nuevos compuestos antibióticos contra mecanismos de resistencia conocidos, y la dereplicación de antibióticos conocidos en extractos derivados de actinobacterias y otros microbios. Aquí, nos centramos en su aplicación en la dereplicación de antibióticos. El ARP utiliza una biblioteca de cepas isogénicas de Escherichia coli que expresan genes de resistencia individuales que son eficaces contra los antibióticos más comúnmente redescubiertos14,15. Cuando la biblioteca de E. coli se cultiva en presencia de un organismo secundario productor de metabolitos, la identidad del compuesto puede deducirse por el crecimiento de cepas de E. coli que expresan su gen de resistencia asociado10. Cuando se informó por primera vez de la ARP, la biblioteca consistió en >40 genes que confieren resistencia a 16 clases de antibióticos. La plantilla de desreplicación original fue diseñada para abarcar un subconjunto de genes de resistencia por clase de antibióticos para proporcionar información sobre la subclase de antibióticos durante el proceso de desreplicación. Hoy en día, la ARP se compone de >90 genes que confieren resistencia a 18 clases de antibióticos. Utilizando nuestra extensa colección de genes de resistencia, se ha desarrollado una plantilla de desreplicación secundaria que se conoce como la plataforma de resistencia mínima a los antibióticos (MARP). Esta plantilla fue creada para eliminar la redundancia genética y simplemente proporcionar información sobre la clase general de antibióticos con la que está relacionado un metabolito desreplicado. Además, la plantilla MARP posee tanto el tipo salvaje como una cepa deficiente hiperpermeable/eflujo de E. coli BW25113 (E. coli BW25113 –bamBtolC),en comparación con la encarnación original de la ARP, que sólo utiliza la cepa hiperpermeable. Este aspecto único crea fenotipos adicionales durante la dereplicación, lo que indica una capacidad de compuestos para cruzar la membrana externa de las bacterias Gram-negativas. Aquí, describimos un protocolo robusto a seguir al dereplicar con el ARP y/o MARP, resaltamos los pasos más críticos a seguir, y discutimos los diversos resultados posibles.

Protocol

1. Preparación de las existencias de glicerol de la biblioteca E. coli (a partir de inclinadores de agar) Rayar las cepas ARP/MARP E. coli del caldo de lisabagenia (LB) inclina sobre platos de Petri que contienen agar LB y el marcador seleccionable apropiado (Tabla 1). Preparar cultivos para cada una de las cepas de E. coli inoculando 3 ml de LB que contengan el marcador seleccionable apropiado con una sola colonia. Crecer durante la noche a 37oC con aireac…

Representative Results

Los siguientes resultados se obtuvieron cuando se desató una colección de cepas de interés productoras de antibióticos utilizando el ARP y/o ELP. En la Figura 1se muestra un diagrama del flujo de trabajo de desreplicación ARP/MARP y los mapas de placas de biblioteca se muestran en la Figura suplementaria 1 y en la Figura complementaria 2. La Figura 2 demuestra un resultado positivo de desreplicac…

Discussion

El protocolo descrito anteriormente puede aplicarse tanto al descubrimiento de nuevos compuestos antimicrobianos como a los adyuvantes que pueden utilizarse junto con los antibióticos existentes para rescatar su actividad. La plataforma aprovecha la alta especificidad del sustrato de los mecanismos de resistencia y sus antibióticos cognados, para desreplicar compuestos dentro de extractos de productos naturales crudos. Aunque el tiempo necesario para que las placas de desreplicación se preparen es largo (2 semanas), e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La investigación en el laboratorio Wright relacionada con el ARP/MARP fue apoyada por el Fondo de Investigación de Ontario y la subvención de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (FRN-148463). Nos gustaría reconocer a Sommer Chou por ayudar en la expansión y organización de la biblioteca ARP.

Materials

Agar Bio Shop AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage Sigma-Aldrich Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt Bio Shop AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) Becton Dickinson 212322
BBL Phytone Peptone (Soytone) Becton Dickinson 211906
Calcium Carbonate Bio Shop CAR303.500
Casamino acid Bio Basic 3060
Cotton-Tipped Applicators Fisher Scientific 23-400-101
CryoPure Tube 1.8ml mix.colour Sarstedt 72.379.992
D-glucose Bio Shop GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16x100mm Fisher Scientific 14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous Commercial Alcohols P016EAAN
Glass Beads, Solid Fisher Scientific 11-312C
Glycerol Bio Shop GLY001.4
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-212
Instant sealing sterilization pouch Fisher Scientific 01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate Sigma-Aldrich F7002-250G
Kanamycin Sulfate Bio Shop KAN201.50
LB Broth Lennox Bio Shop LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate Fisher Scientific M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size Millipore-Sigma HAWP00010 10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base Sarstedt 82.1582.001
New Brunswick Innova 44 Eppendorf M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate Thermo Fisher Scientific 264728 with lid, sterile, non treated
Petri dish 92x16mm with cams Sarstedt 82.1473.001
Pinning tools ETH Zurich Custom order
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potato starch Bulk Barn 279
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Sodium Nitrate Fisher Scientific S343-500
Wood Applicators Dukal Corporation 9000
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2

References

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Cite This Article
Zubyk, H. L., Cox, G., Wright, G. D. Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform. J. Vis. Exp. (152), e60536, doi:10.3791/60536 (2019).

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