Ensayo de formación de presinapse utilizando cuentas organizadoras de presinapsiona y cultura de "Bola de neurona"
Summary
La formación de presinapsis es un proceso dinámico que incluye la acumulación de proteínas sinápticas en el orden correcto. En este método, la formación de presináptica se desencadena por perlas conjugadas con una proteína organizadora de la presinapsis en láminas axonales del cultivo de “bola de neurona”, por lo que la acumulación de proteínas sinápticas es fácil de analizar durante la formación de la presinapsis.
Abstract
Durante el desarrollo neuronal, la formación de sinapsis es un paso importante para establecer circuitos neuronales. Para formar sinapsis, las proteínas sinápticas deben suministrarse en el orden adecuado mediante el transporte desde cuerpos celulares y/o la traducción local en sinapsis inmaduras. Sin embargo, no se entiende completamente cómo las proteínas sinápticas se acumulan en las sinapsis en el orden correcto. Aquí, presentamos un método novedoso para analizar la formación presináptica mediante el uso de la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis. Las bolas neuronales que son agregados de células neuronales proporcionan hojas axonales lejos de los cuerpos celulares y dendritas, de modo que las señales fluorescentes débiles de las presinapciones pueden detectarse evitando señales abrumadoras de cuerpos celulares. Como perlas para desencadenar la formación de presinapsis, utilizamos cuentas conjugadas con la repetición de leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), un organizador presináptico excitatorio. Usando este método, demostramos que el transportador de glutamato vesicular 1 (vGlut1), una proteína de vesícula sináptica, acumulada en presinapciones más rápido que Munc18-1, una proteína de zona activa. Munc18-1 acumuló la traducción dependiente en la presinapsis incluso después de eliminar los cuerpos celulares. Este hallazgo indica la acumulación munc18-1 por traducción local en axónes, no el transporte desde cuerpos celulares. En conclusión, este método es adecuado para analizar la acumulación de proteínas sinápticas en presinapis y fuente de proteínas sinápticas. Como el cultivo de bolas de neuronas es simple y no es necesario utilizar aparatos especiales, este método podría ser aplicable a otras plataformas experimentales.
Introduction
La formación de sinapsis es uno de los pasos críticos durante el desarrollo de los circuitos neuronales1,2,3. La formación de sinapsis especializadas compuestas por pre y post-sinapsis es un proceso complejo y multipaso que implica el reconocimiento adecuado de los axónes y dendritas, la formación de la zona activa y la densidad postsináptica, y la alineación adecuada de canales ióniónicos y receptores de neurotransmisores1,2. En cada proceso, muchos tipos de proteínas sinápticas se acumulan en estos compartimentos especializados en el momento adecuado mediante el transporte de proteínas sinápticas de los cuerpos celulares y / o por traducción local en los compartimentos. Estas proteínas sinápticas se consideran dispuestas de manera organizada para formar sinapsis funcionales. La disfunción de algunas proteínas sinápticas que implican la formación de sinapsis da como resultado enfermedades neurológicas4,5. Sin embargo, sigue sin estar claro cómo se acumulan las proteínas sinápticas en el momento adecuado.
Para investigar cómo se acumulan las proteínas sinápticas de forma organizada, es necesario examinar la acumulación de proteínas sinápticas en orden cronológico. Algunos informes demostraron imágenes en vivo para observar la formación de sinapsis en el cultivo disociado de las neuronas6,7. Sin embargo, es lento encontrar neuronas que simplemente comienzan la formación de sinapsis bajo microscopía. Para observar la acumulación de proteínas sinápticas eficientemente, la formación de sinapsis debe comenzar en el momento en que los investigadores quieren inducir la formación. El segundo desafío es distinguir la acumulación de proteínas sinápticas debido al transporte de los cuerpos celulares o la traducción local en sinapsis. Para ello, es necesario medir el nivel de traducción bajo la condición que no permite el transporte de proteínas sinápticas de los cuerpos celulares.
Desarrollamos un nuevo ensayo de formación de presinapsis utilizando la combinación de cultivo de bolas de neuronas con cuentas para inducir la formación de presinapsis8. El cultivo de la bola de neuronas se desarrolla para examinar el fenotipoaxonal, debido a la formación de láminas axonales que rodean los cuerpos celulares 9,10. Utilizamos cuentas magnéticas conjugadas con la reacción transmembrana neuronal 2 (LRRTM2) rica en leucina que es un organizador presináptico para inducir presinapciones excitatorias (Figura1A)11,12,13. Mediante el uso de las perlas LRRTM2, la formación de presinapsivas comienza en el momento en que se aplican las perlas. Esto significa que la formación de presinapsis comienza en miles de axónes de una bola de neurona al mismo tiempo, por lo que permite examinar el curso preciso del tiempo de acumulación de proteínas sinápticas de manera eficiente. Además, el cultivo de bolas de neuronas es fácil de bloquear las proteínas sinápticas de transporte del soma mediante la eliminación de cuerpos celulares (Figura 1B)8. Ya hemos confirmado que los axons sin cuerpos celulares pueden sobrevivir y están sanos al menos 4 h después de la eliminación de los cuerpos celulares. Por lo tanto, este protocolo es adecuado para investigar de dónde se derivan las proteínas sinápticas (cuerpo celular o axón), y cómo se acumulan las proteínas sinápticas de manera organizada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desarrollamos un método novedoso para examinar la formación de presinapnasa estimulada con LRRTM2-perlas utilizando el cultivo de bolas de neuronas. Actualmente, la mayor parte del ensayo de formación de presinapestos incluye cuentas recubiertas de poli-D-lisina (PDL) y cultivo disociado/cámara microfluídica20,21,22. Una de las ventajas de este método es LRRTM2-beads. Mientras que LRRTM2 interactúa con la neurexina para f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo está respaldado en parte por JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (No 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Agradecemos al Dr. Terukazu Nogi y a la Sra. Makiko Neyazaki (Universidad de la Ciudad de Yokohama) por proporcionar amablemente proteína lRRTM2 biotinilada. También damos las gracias a Honami Uechi y Rie Ishii por su asistencia técnica.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
