Summary

Ensaio de formação presynapse usando Presynapse organizador contas e "Neuron Ball" cultura

Published: August 02, 2019
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Summary

A formação de presynapse é um processo dinâmico que inclui a acumulação de proteínas sináptica na ordem apropriada. Neste método, a formação do presynapse é provocada pelos grânulos conjugados com uma proteína do organizador do presynapse em folhas axonal da cultura da esfera do Neuron do “”, de modo que a acumulação de proteínas sináptica seja fácil de ser analisada durante a formação do presynapse.

Abstract

Durante o desenvolvimento neuronal, a formação de sinapse é um passo importante para estabelecer circuitos neurais. Para formar sinapses, as proteínas sinápticas devem ser fornecidas em ordem apropriada pelo transporte de corpos celulares e/ou tradução local em sinapses imaturas. No entanto, não é totalmente compreendido como as proteínas sinápticas se acumulam em sinapses em ordem adequada. Aqui, nós apresentamos um método novo para analisar a formação pré-sináptica usando a combinação da cultura da esfera do neurônio com os grânulos para induzir a formação do presynapse. As esferas do Neuron que são agregados da pilha neuronal fornecem as folhas axonal longe dos corpos e dos dendrites da pilha, de modo que os sinais fluorescentes fracos dos presynapses possam ser detectados evitando sinais esmagadores de corpos da pilha. Como grânulos para desencadear a formação de presynapse, usamos grânulos conjugados com repetição rica em leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), um organizador pré-sináptica excitatória. Usando este método, Nós demonstramos que o transportador vesicular 1 do glutamato (vGlut1), uma proteína sináptica do vesícula, acumulada em presynapses mais rapidamente do que Munc18-1, uma proteína da zona ativa. Munc18-1 acumulou a tradução-dependente no presynapse mesmo depois de remover corpos de pilha. Este achado indica o acúmulo de Munc18-1 por tradução local em axônios, não transporte de corpos celulares. Em conclusão, este método é apropriado analisar a acumulação de proteínas sináptica em presynapses e na fonte de proteínas sináptica. Como a cultura da esfera do neurônio é simples e não é necessário usar o instrumento especial, este método poderia ser aplicável a outras plataformas experimentais.

Introduction

A formação de sinapse é uma das etapas críticas durante o desenvolvimento de circuitos neurais1,2,3. A formação de sinapses especializadas em compartimentos compostos de pré e pós-sinapses é um processo complexo e multipasso que envolve o reconhecimento adequado de axônios e dendritos, formação de zona ativa e densidade pós-sináptica, e alinhamento adequado de canais iônicos e receptores neurotransmissores1,2. Em cada processo, muitos tipos de proteínas sinápticas se acumulam a estes compartimentos especializados em tempo adequado, transportando proteínas sinápticas de corpos celulares e/ou por tradução local nos compartimentos. Estas proteínas sinápticas são consideradas dispostas de forma organizada para formar sinapses funcionais. Disfunção de algumas proteínas sinápticas envolvendo a formação de sinapse resulta em doenças neurológicas4,5. Entretanto, permanece obscuro como as proteínas sináptica acumulam no sincronismo apropriado.

Para investigar como as proteínas sinápticas se acumulam de forma organizada, é necessário examinar a acumulação de proteínas sinápticas em ordem cronológica. Alguns relatos demonstraram imagens ao vivo para observar a formação de sinapse em cultura dissociada de neurônios6,7. Entretanto, é demorado encontrar os neurônios que apenas começam a formação do sinapse a microscopia. Para observar a acumulação de proteínas sinápticas de forma eficiente, a formação de sinapse deve começar no momento em que os pesquisadores querem induzir a formação. O segundo desafio é distinguir o acúmulo de proteínas sinápticas devido ao transporte de corpos celulares ou tradução local em sinapses. Para esse efeito, o nível de tradução é necessário para ser medido a condição de que não permite o transporte de proteínas sinápticas de corpos celulares.

Nós desenvolvemos o ensaio novo da formação do presynapse usando a combinação de cultura da esfera do neurônio com grânulos para induzir a formação do presynapse8. A cultura da esfera do Neuron é desenvolvida para examinar o phenotype axonal, devido à formação de folhas axonal que cercam corpos da pilha9,10. Foram utilizados grânulos magnéticos conjugados com repetição rica em leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2) que é um organizador pré-sináptico para induzir presynapses excitatórias (Figura 1a)11,12,13. Usando os grânulos LRRTM2, a formação do presynapse começa no momento em que os grânulos são aplicados. Isto significa que a formação de pré-sinapse começa em milhares de axônios de uma bola de neurônio ao mesmo tempo, assim, permite examinar o curso de tempos precisos de acumulação de proteínas sináptica eficientemente. Além disso, a cultura da bola de neurônio é fácil de bloquear o transporte de proteínas sinápticas de soma removendo corpos celulares (Figura 1b)8. Já confirmamos que os axônios sem corpos celulares podem sobreviver e são saudáveis pelo menos 4 h após a remoção de corpos celulares. Assim, este protocolo é adequado para investigar a partir de onde as proteínas sinápticas são derivadas (corpo celular ou AXON), e como as proteínas sinápticas se acumulam de forma organizada.

Protocol

Os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com as diretrizes delineadas no Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade da cidade de Yokohama. 1. preparação de esferas do neurônio como a cultura de suspensão da gota (dias in vitro (div) 0-3) Nota: os procedimentos descritos aqui para a preparação da cultura da esfera do neurônio são baseados no método relatado previamente pelo grupo de Sasaki com alguma…

Representative Results

Aqui, nós mostramos resultados representativos da acumulação de proteínas pré-sináptica em presynapses LRRTM2-induced de folhas axonal da cultura da esfera do neurônio. Como proteínas pré-sinápticas, foi analisada a proteína de vesículas excitatórias vGlut1 e a proteína da zona ativa Munc18-1. Nós igualmente examinamos o curso do tempo da acumulação de vGlut1 e de Munc18-1 em presynapses, e obtivemos resultados que indicam a fonte de Munc18-1 nos presynapses usando axônios que removemos corpos de pilha …

Discussion

Nós desenvolvemos o método novo para examinar a formação do presynapse estimulada com LRRTM2-Beads usando a cultura da esfera do neurônio. Atualmente, a maior parte do ensaio de formação pré-sinapse inclui grânulos revestidos de poli-D-lisina (PDL) e cultura dissociada/câmara microfluídica20,21,22. Uma das vantagens deste método é LRRTM2-Beads. Quando LRRTM2 interagir com o neurexin para dar forma a presynapses exci…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é parcialmente apoiado pelo JSPS Grant-in-Aid para a pesquisa científica (KAKENHI) (C) (no. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Agradecemos ao Dr. Terukazu Nogi e à Sra. Makiko Neyazaki (Universidade da cidade de Yokohama) por gentilmente fornecer proteína LRRTM2 biotinylated. Agradecemos também Honami Uechi e rie Ishii pela assistência técnica.

Materials

Antibody diluent DAKO S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-545-152
mouse anti-Munc18-1 BD Biosciences 610336
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA) Nacalai Tesque 01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) Nunc 176740
Complete EDTA-free Roche 11873580001
cooled CCD camera Andor Technology iXON3
Coverslip Matsunami C015001 Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) Nacalai Tesque 11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I) Wako pure chemicals 047-26771
Expi293 Expression System Thermo Fisher Scientific A14635
Horse serum Sigma-Aldrich H1270
image acquisition software Nikon NIS-element AR
Image analysis software NIH Image J https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope Nikon Eclipse Ti-E
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Neurobasal media Thermo Fisher Scientific #21103-049
Normal Goat Serum (NGS) Thermo Fisher Scientific #143-06561
N-propyl gallate Nacalai Tesque 29303-92
Paraformaldehyde (PFA) Nacalai Tesque 26126-25

Paraplast Plus
Sigma-Aldrich P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) Nacalai Tesque 28359-54
poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns GE healthcare 17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 Synaptic Systems 135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) Nacalai Tesque 41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles Spherotech Inc SVM-40-10 diameter: 4-5 µm
TritonX-100 Nacalai Tesque 35501-15
Trypsin Nacalai Tesque 18172-94

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Cite This Article
Parvin, S., Takeda, R., Sasaki, Y. Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and “Neuron Ball” Culture. J. Vis. Exp. (150), e59893, doi:10.3791/59893 (2019).

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