Presynapse تشكيل التبيّن باستخدام الخرز المنظم Presynapse و "الكرة العصبية" الثقافة
Summary
تشكيل Presynapse هو عملية ديناميكية بما في ذلك تراكم البروتينات متشابك في الترتيب السليم. في هذه الطريقة، يتم تشغيل تشكيل presynapse بواسطة الخرز المترافق مع بروتين منظم presynapse على أوراق axonal من ثقافة “الكرة العصبية”، بحيث تراكم البروتينات متشابك من السهل تحليلها خلال تشكيل presynapse.
Abstract
خلال تطوير الخلايا العصبية، تشكيل المشبك هو خطوة هامة لإنشاء الدوائر العصبية. لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي، يجب توفير البروتينات متشابك في الترتيب المناسب عن طريق النقل من الهيئات الخلية و / أو الترجمة المحلية في نقاط الاشتباك العصبي غير ناضجة. ومع ذلك، فإنه ليس من المفهوم تماما كيف تتراكم البروتينات متشابك في نقاط الاشتباك العصبي في الترتيب السليم. هنا، نقدم طريقة جديدة لتحليل تشكيل presynaptic باستخدام مزيج من ثقافة الكرة العصبية مع الخرز للحث على تشكيل presynapse. كرات الخلايا العصبية التي هي المجاميع الخلايا العصبية توفر أوراق axonal بعيدا عن أجسام الخلايا وdendrites، بحيث يمكن الكشف عن إشارات الفلورسنت ضعيفة من presynapses عن طريق تجنب إشارات ساحقة من أجسام الخلايا. كما الخرز لتحريك تشكيل presynapse، ونحن نستخدم الخرز المترافق مع اللوين الغنية تكرار الخلايا العصبية عبر الغشاء 2 (LRRTM2)، وهو منظم presynaptic مثير. باستخدام هذه الطريقة، أظهرنا أن الغلوتامات الحويصلي الناقل 1 (vGlut1)، وهو بروتين الحويصلة متشابك، المتراكمة في presynapses أسرع من Munc18-1، وهو بروتين منطقة نشطة. Munc18-1 المتراكمة الترجمة تعتمد في presynapse حتى بعد إزالة الهيئات الخلية. وتشير هذه النتيجة إلى تراكم Munc18-1 عن طريق الترجمة المحلية في المحاور، وليس النقل من أجسام الخلايا. في الختام، هذه الطريقة مناسبة لتحليل تراكم البروتينات متشابك في presynapses ومصدر البروتينات متشابك. كما ثقافة الكرة العصبية بسيطة وليس من الضروري استخدام جهاز خاص، يمكن أن تكون هذه الطريقة قابلة للتطبيق على منصات تجريبية أخرى.
Introduction
تشكيل متشابك هو واحد من الخطوات الحاسمة أثناء تطوير الدوائر العصبية1،2،3. تشكيل نقاط الاشتباك العصبي التي هي مقصورات متخصصة تتكون من ما قبل وبعد نقاط الاشتباك العصبي هو عملية معقدة ومتعددة الخطوات تنطوي على الاعتراف المناسب للمحاور وdendrites، وتشكيل المنطقة النشطة وكثافة postynaptic، والمحاذاة المناسبة لل قنوات أيون ومستقبلات الناقل العصبي1,2. في كل عملية، تتراكم أنواع كثيرة من البروتينات متشابك إلى هذه المقصورات المتخصصة في توقيت مناسب عن طريق نقل البروتينات متشابك من أجسام الخلايا و / أو عن طريق الترجمة المحلية في المقصورات. وتعتبر هذه البروتينات متشابك ليتم ترتيبها بطريقة منظمة لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية. خلل في بعض البروتينات متشابك التي تنطوي على تكوين متشابك يؤدي إلى الأمراض العصبية4,5. ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح كيف تتراكم البروتينات متشابك في التوقيت المناسب.
للتحقيق في كيفية تراكم البروتينات متشابك بطريقة منظمة، فمن الضروري لدراسة تراكم البروتينات متشابك في الترتيب الزمني. وأظهرت بعض التقارير التصوير الحي لمراقبة تشكيل متشابك في ثقافة منفصلة من الخلايا العصبية6،7. ومع ذلك، فإنه من يستغرق وقتا طويلا للعثور على الخلايا العصبية التي تبدأ للتو تشكيل متشابك تحت الفحص المجهري. لمراقبة تراكم البروتينات متشابك بكفاءة، يجب أن يبدأ تشكيل متشابك في الوقت الذي يريد الباحثون للحث على تشكيل. والتحدي الثاني هو التمييز بين تراكم البروتينات المتشابكة بسبب النقل من أجسام الخلايا أو الترجمة المحلية في نقاط الاشتباك العصبي. ولهذا الغرض، من الضروري قياس مستوى الترجمة في ظل شرط لا يسمح بنقل البروتينات المتشابكة من أجسام الخلايا.
قمنا بتطوير رواية presynapse تشكيل التبيّن باستخدام مزيج منثقافة الكرة العصبية مع الخرز للحث على تشكيل presynapse 8. تم تطوير ثقافة الكرة العصبية لفحص النمط الظاهري المحاور، وذلك بسبب تشكيل أوراق axonal المحيطة الهيئات الخلية9،10. استخدمنا الخرز المغناطيسي المترافق مع اللوشأنهين الغنية تكرار الخلايا العصبية عبر الغشاء 2 (LRRTM2) وهذا هو منظم presynaptic للحث على presynapses الإثارة (الشكل1A)11،12،13. باستخدام الخرز LRRTM2، يبدأ تشكيل presynapse في الوقت الذي يتم فيه تطبيق الخرز. وهذا يعني أن تشكيل presynapse يبدأ في الآلاف من محاور الكرة العصبية في نفس الوقت، وبالتالي فإنه يسمح لدراسة مسار زمني دقيق من تراكم البروتينات متشابك بكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ثقافة الكرة العصبية من السهل منع نقل البروتينات متشابك من سوما عن طريق إزالة الهيئات الخلية (الشكل1B)8. وقد أكدنا بالفعل أن المحاور التي لا تحتوي على أجسام خلوية يمكن أن تبقى على قيد الحياة وأنها صحية على الأقل 4 ساعة بعد إزالة أجسام الخلايا. وهكذا، فإن هذا البروتوكول مناسب للتحقيق من حيث يتم اشتقاق البروتينات متشابك (جسم الخلية أو محور عصبي)، وكيف تتراكم البروتينات متشابك بطريقة منظمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
قمنا بتطوير طريقة جديدة لدراسة تشكيل presynapse حفز مع LRRTM2-الخرز باستخدام ثقافة الكرة العصبية. حاليا، معظم اختبار تشكيل presynapse يشمل بولي-D-يسين (PDL) الخرز المغلفة والثقافة المنفصلة / غرفة microfluidic20،21،22. واحدة من مزايا هذه الطريقة هو LRRTM2 الخرز. في ح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل جزئيا ً منحة المساعدة المقدمة للبحوث العلمية (KaKENHI) (C) (رقم 22500336، 25430068، 16K07061) (Y. Sasaki). نشكر الدكتور تيروكوزو نوجي والسيدة ماكيكو نيازاكي (جامعة مدينة يوكوهاما) على تقديم بروتين LRRTM2 البيوتيني. ونشكر أيضا هونامي أوتشي وري إيشي على المساعدة التقنية.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
- Waites, C. L., Craig, A. M., Garner, C. C. Mechanisms of Vertebrate Synaptogenesis. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 251-274 (2005).
- Ziv, N. E., Garner, C. C. Cellular and molecular mechanisms of presynaptic assembly. Nature Reviews Neuroscience. 5 (5), 385-399 (2004).
- Chia, P. H., Li, P., Shen, K. Cellular and molecular mechanisms underlying presynapse formation. Journal of Cell Biology. 203 (1), 11-22 (2013).
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Saitsu, H., et al. CASK aberrations in male patients with Ohtahara syndrome and cerebellar hypoplasia. Epilepsia. 53 (8), 1441-1449 (2012).
- Friedman, H. V., Bresler, T., Garner, C. C., Ziv, N. E. Assembly of New Individual Excitatory Synapses. Neuron. 27 (1), 57-69 (2000).
- Bresler, T., et al. Postsynaptic density assembly is fundamentally different from presynaptic active zone assembly. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24 (6), 1507-1520 (2004).
- Parvin, S., Takeda, R., Sugiura, Y., Neyazaki, M., Nogi, T., Sasaki, Y. Fragile X mental retardation protein regulates accumulation of the active zone protein Munc18-1 in presynapses via local translation in axons during synaptogenesis. Neuroscience Research. , (2018).
- Sasaki, Y., et al. Phosphorylation of Zipcode Binding Protein 1 Is Required for Brain-Derived Neurotrophic Factor Signaling of Local β-Actin Synthesis and Growth Cone Turning. Journal of Neuroscience. 30 (28), 9349-9358 (2010).
- Sasaki, Y., Gross, C., Xing, L., Goshima, Y., Bassell, G. J. Identification of axon-enriched microRNAs localized to growth cones of cortical neurons. Developmental neurobiology. 74 (3), 397-406 (2014).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Hirai, H., et al. Structural basis for ligand capture and release by the endocytic receptor ApoER2. EMBO reports. , (2017).
- Yasui, N., et al. Functional Importance of Covalent Homodimer of Reelin Protein Linked via Its Central Region. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 35247-35256 (2011).
- Bassell, G. J., Warren, S. T. Fragile X Syndrome: Loss of Local mRNA Regulation Alters Synaptic Development and Function. Neuron. 60 (2), 201-214 (2008).
- Darnell, J. C., Klann, E. The translation of translational control by FMRP: therapeutic targets for FXS. Nat Neurosci. 16 (11), 1530-1536 (2013).
- Richter, J. D., Bassell, G. J., Klann, E. Dysregulation and restoration of translational homeostasis in fragile X syndrome. Nature Reviews Neuroscience. 16 (10), 595-605 (2015).
- Lucido, A. L., et al. Rapid Assembly of Functional Presynaptic Boutons Triggered by Adhesive Contacts. Journal of Neuroscience. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal Translation of β-Catenin Regulates Synaptic Vesicle Dynamics. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Batista, A. F. R., Martínez, J. C., Hengst, U. Intra-axonal Synthesis of SNAP25 Is Required for the Formation of Presynaptic Terminals. Cell reports. 20 (13), 3085-3098 (2017).
