シナプス前オーガナイザービーズと「ニューロンボール」培養を用いたシナプス形成アッセイ
Summary
シナプス前形成は、シナプスタンパク質の蓄積を含む動的なプロセスを適切な順序で行う。この方法では、シナプス前形成は「ニューロンボール」培養物の軸シート上にプレシナプスオーガナイザータンパク質と結合したビーズによって引き起こされ、シナプス形成前にシナプスタンパク質の蓄積が解析されやすくなる。
Abstract
神経発達の間、シナプス形成は神経回路を確立するための重要なステップである。シナプスを形成するには、シナプスタンパク質は、細胞体からの輸送および/または未熟なシナプスにおける局所翻訳によって適切な順序で供給されなければならない。しかし、シナプスタンパク質がシナプスに適切な順序で蓄積する方法を完全に理解していません。ここでは、ニューロンボール培養とビーズの組み合わせを用いてシナプス前形成を誘導する新しい方法を提示する。ニューロン細胞凝集体であるニューロンボールは、細胞体やデンドライトから遠く離れた軸シートを提供するため、細胞体の圧倒的なシグナルを避けることで、シナプス前の弱い蛍光シグナルを検出することができます。シナプス前形成を引き起こすビーズとして、刺激性前シナプスオーガナイザーであるロイシンリッチリピート膜神経神経2(LRRTM2)と共役のビーズを使用します。この方法を用いて、シナプス小胞タンパク質である小胞性グルタミン酸トランスポーター1(vGlut1)が、活性ゾーンタンパク質であるMunc18-1よりも早くプレシナプスに蓄積することを実証した。Munc18-1は、細胞体を除去した後も、プレシナプスに翻訳依存的に蓄積した。この知見は、細胞体からの輸送ではなく、軸ゾンにおける局所翻訳によるMunc18-1蓄積を示す。結論として、この方法は、シナプス前シナプスおよびシナプスタンパク質の供給源におけるシナプスタンパク質の蓄積を分析するのに適している。ニューロンボール培養は単純で、特別な装置を使用する必要がないため、この方法は他の実験プラットフォームにも適用可能です。
Introduction
シナプス形成は、神経回路1、2、3の発達中の重要なステップの1つである。シナプス前およびポストシナプスで構成される特殊なコンパートメントであるシナプスの形成は、軸線とデンドライトの適切な認識、活性ゾーンおよびポストシナプス密度の形成、および適切なアライメントを伴う複雑で多段階のプロセスである。イオンチャネルおよび神経伝達物質受容体1、2.各プロセスでは、多くの種類のシナプスタンパク質が、細胞体からシナプスタンパク質を輸送したり、コンパートメント内の局所翻訳によって適切なタイミングでこれらの特殊なコンパートメントに蓄積します。これらのシナプスタンパク質は、機能性シナプスを形成するために組織的に配置されていると考えられる。シナプス形成を伴ういくつかのシナプスタンパク質の機能不全は、神経疾患4,5をもたらす。しかし、シナプスタンパク質が適切なタイミングでどのように蓄積するかは不明です。
シナプスタンパク質がどのように組織的に蓄積するかを調べるには、シナプスタンパク質の蓄積を時系列順に調べる必要があります。いくつかの報告は、ニューロン6、7の解離培養におけるシナプス形成を観察するライブイメージングを実証した。しかし、顕微鏡検査の下でシナプス形成を開始するニューロンを見つけるのは時間がかかります。シナプスタンパク質の蓄積を効率的に観察するには、研究者が形成を誘導したい時にシナプス形成を開始する必要があります。第2の課題は、細胞体からの輸送またはシナプス中の局所翻訳によるシナプスタンパク質の蓄積を区別することです。そのためには、細胞体からのシナプスタンパク質の輸送を許可しない条件下で翻訳レベルを測定する必要があります。
ニューロンボール培養とビーズの組み合わせを用いて、シナプス前形成を誘導する新規のシナプス形成アッセイを開発した。ニューロン球培養は、細胞体9、10を取り巻く軸シートの形成に起因する軸次表現型を調べるために開発される。興奮前シナプスを誘導する前シナプスオーガナイザーであるロイシンリッチリピート膜神経神経2(LRRTM2)と共役した磁気ビーズ(図1A)11、12、13を用いた。LRRTM2ビーズを用いることで、ビーズが塗布された時点でシナプス形成が開始される。これは、シナプス前形成がニューロンボールの数千の軸で同時に始まることを意味し、したがって、シナプスタンパク質の蓄積の正確な時間経過を効率的に調べることができる。また、ニューロンボール培養は、細胞体を除去することにより、ソマからのシナプスタンパク質の輸送をブロックすることが容易である(図1B)8.我々はすでに、細胞体のない軸ソンが生き残ることができ、細胞体を除去した後、少なくとも4時間は健康であることを確認しました。したがって、このプロトコルは、シナプスタンパク質がどこから(細胞体または軸)由来し、シナプスタンパク質が組織的に蓄積するかを調するのに適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ニューロンボール培養を用いてLRRTM2ビーズで刺激されたシナプス前形成を調べる新しい方法を開発した。現在、シナプス前形成アッセイのほとんどは、ポリD-リジン(PDL)コーティングビーズおよび解離培養/マイクロ流体室20、21、22を含む。この方法の利点の1つはLRRTM2ビーズです。LRRTM2は、特異的に11、12、13、PDLビーズを形…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、JSPS科学研究助成金(KAKENHI)(第2250036号、25430068、16K07061)(佐々木Y.生体化LRRTM2タンパク質を提供してくださった野木輝和先生と寝屋崎真紀子さん(横浜市立大学)に感謝申し上げます。また、上地穂波さんと石井理恵さんの技術支援にも感謝します。
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
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