Saggio di formazione Presynapse utilizzando perline dell'organizzatore della presynapsi e cultura "Neuron Ball"
Summary
La formazione della presilnapsi è un processo dinamico che include l’accumulo di proteine sinaptiche nell’ordine corretto. In questo metodo, la formazione del presilnapsi è innescata da perline coniugate con una proteina organizzatore presilnapse su fogli assonali di cultura “palla di neurone”, in modo che l’accumulo di proteine sinaptiche sia facile da analizzare durante la formazione del presilnapsi.
Abstract
Durante lo sviluppo neuronale, la formazione di sinapsi è un passo importante per stabilire circuiti neurali. Per formare le sinapsi, le proteine sinaptiche devono essere fornite in ordine appropriato mediante il trasporto da corpi cellulari e/o traduzioni locali in sinapsi immature. Tuttavia, non è completamente compreso come le proteine sinaptiche si accumulano nelle sinapsi in ordine corretto. Qui, presentiamo un nuovo metodo per analizzare la formazione presinaptica utilizzando la combinazione della coltura della palla del neurone con perline per indurre la formazione di presynapsi. Le sfere di neuroni che sono aggregati di cellule neuronali forniscono fogli assonali lontani dai corpi cellulari e dai dendriti, in modo che i deboli segnali fluorescenti di presynapsi possano essere rilevati evitando segnali schiaccianti di corpi cellulari. Come perline per innescare la formazione di presynapsi, usiamo perline coniugate con transmembrana ripetuta ricca di leucina neurone 2 (LRRTM2), un organizzatore pressinaptico eccitatorio. Utilizzando questo metodo, abbiamo dimostrato che il trasportatore di glutammato vescicolare 1 (vGlut1), una proteina vescica sinaptica, si è accumulata nei presilnapsi più velocemente di Munc18-1, una proteina della zona attiva. Munc18-1 ha accumulato la traduzione in modo dipendente nella pressinapse anche dopo la rimozione dei corpi cellulari. Questo risultato indica l’accumulo di Munc18-1 per traduzione locale negli assoni, non il trasporto da corpi cellulari. In conclusione, questo metodo è adatto per analizzare l’accumulo di proteine sinaptiche nei presilnapsi e la fonte di proteine sinaptiche. Poiché la cultura della palla neuronale è semplice e non è necessario utilizzare un apparato speciale, questo metodo potrebbe essere applicabile ad altre piattaforme sperimentali.
Introduction
La formazione di sinapsi è uno dei passaggi critici durante lo sviluppo dei circuiti neurali1,2,3. La formazione di sinapsi specializzate composti da post-sinapsi è un processo complesso e multifase che prevede un adeguato riconoscimento di assoni e dendriti, formazione di zona attiva e densità post-sinaptica e un corretto allineamento canali ionici e recettori del neurotrasmettitore1,2. In ogni processo, molti tipi di proteine sinaptiche si accumulano in questi compartimenti specializzati in tempi adeguati trasportando proteine sinaptiche da corpi cellulari e/o mediante traduzione locale nei compartimenti. Queste proteine sinaptiche sono considerate organizzate in modo organizzato per formare sinapsi funzionali. La disfunzione di alcune proteine sinaptiche che coinvolgono la formazione di sinapsi provoca malattie neurologiche4,5. Tuttavia, non è chiaro come le proteine sinaptiche si accumulino in tempi adeguati.
Per studiare come le proteine sinaptiche si accumulano in modo organizzato, è necessario esaminare l’accumulo di proteine sinaptiche in ordine cronologico. Alcuni rapporti hanno dimostrato l’imaging dal vivo per osservare la formazione di sinapsi nella coltura dissociata dei neuroni6,7. Tuttavia, è necessario molto tempo per trovare neuroni che iniziano solo la formazione di sinapsi sotto microscopia. Per osservare l’accumulo di proteine sinaptiche in modo efficiente, la formazione delle sinapsi deve iniziare nel momento in cui i ricercatori vogliono indurre la formazione. La seconda sfida consiste nel distinguere l’accumulo di proteine sinaptiche dovuto al trasporto da corpi cellulari o alla traduzione locale nelle sinapsi. A tal fine, il livello di traduzione deve essere misurato nella condizione che non consente il trasporto di proteine sinaptiche da corpi cellulari.
Abbiamo sviluppato un nuovo saggio di formazione presynapse utilizzando la combinazione di coltura della palla neurone con perline per indurre la formazione di presynapsi8. La coltura della palla del neurone è sviluppata per esaminare il fenotipo assonale, a causa della formazione di fogli assonali che circondano i corpi cellulari9,10. Abbiamo usato perline magnetiche coniugate con transmembrane transmembrane a ecricca di leucina neuronale 2 (LRRTM2) che è un organizzatore presilnaptico per indurre presynapsi eccitatori (Figura 1A)11,12,13. Utilizzando le perline LRRTM2, la formazione di presynapsi inizia nel momento in cui vengono applicate le perline. Ciò significa che la formazione di presilnapsi inizia in migliaia di assoni di una palla neuronale allo stesso tempo, quindi permette di esaminare in modo preciso il percorso temporale dell’accumulo di proteine sinaptiche in modo efficiente. Inoltre, la coltura della palla neuronale è facile da bloccare il trasporto di proteine sinaptiche dal soma rimuovendo i corpi cellulari (Figura 1B)8. Abbiamo già confermato che gli assoni senza corpi cellulari possono sopravvivere e sono sani almeno 4 h dopo la rimozione dei corpi cellulari. Pertanto, questo protocollo è adatto per studiare da dove derivano le proteine sinaptiche (corpo cellulare o assone) e come le proteine sinaptiche si accumulano in modo organizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per esaminare la formazione di presynapsi stimolata con l’uso di perle l’RRTM2 utilizzando la coltura della palla neuronale. Attualmente, la maggior parte del test di formazione presilnapse include perline rivestite poli-D-lysina (PDL) e coltura dissociata/camera microfluidica20,21,22. Uno dei vantaggi di questo metodo è LRRTM2-perline. Mentre LRRTM2 interagisce con neurexin per formare presyn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è in parte supportato da JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) (n. 22500336, 25430068, 16K07061) (Y. Sasaki). Ringraziamo il Dr. Terukazu Nogi e la signora Makiko Neyazaki (Yokohama City University) per aver gentilmente fornito proteine LRRTM2 biotinylate. Ringraziamo anche Honami Uechi e Rie Ishii per l’assistenza tecnica.
Materials
| Antibody diluent | DAKO | S2022 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-585-151 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| mouse anti-Munc18-1 | BD Biosciences | 610336 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine Serum Alubumin (BSA) | Nacalai Tesque | 01863-48 | |
| Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish) | Nunc | 176740 | |
| Complete EDTA-free | Roche | 11873580001 | |
| cooled CCD camera | Andor Technology | iXON3 | |
| Coverslip | Matsunami | C015001 | Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Nacalai Tesque | 11034-56 | |
| Deoxyribonuclease 1 (DNase I) | Wako pure chemicals | 047-26771 | |
| Expi293 Expression System | Thermo Fisher Scientific | A14635 | |
| Horse serum | Sigma-Aldrich | H1270 | |
| image acquisition software | Nikon | NIS-element AR | |
| Image analysis software | NIH | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Inverted fluorecent microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Neurobasal media | Thermo Fisher Scientific | #21103-049 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Thermo Fisher Scientific | #143-06561 | |
| N-propyl gallate | Nacalai Tesque | 29303-92 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Paraplast Plus |
Sigma-Aldrich | P3558 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000) | Nacalai Tesque | 28359-54 | |
| poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| Prepacked Disposable PD-10 Columns | GE healthcare | 17085101 | |
| rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1 | Synaptic Systems | 135-302 | |
| SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent) | Nacalai Tesque | 41506-04 | |
| Streptavidin-coated magnetic particles | Spherotech Inc | SVM-40-10 | diameter: 4-5 µm |
| TritonX-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Trypsin | Nacalai Tesque | 18172-94 |
References
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