Долиолиды, в том числе вид Dolioletta gegenbauri,являются небольшими желатиновым морским зоопланктоном экологического значения, встречаемым на продуктивных субконтинентальных шельфовых системах по всему миру. Трудность культивирования этих деликатных организмов ограничивает их исследование. В этом исследовании мы описываем подходы к выращиванию для сбора, выращивания и поддержания долиолетта гегенбаури.
Гелатиновские зоопланктоны играют решающую роль в океанских экосистемах. Тем не менее, как правило, трудно исследовать их физиологии, роста, плодовитости и трофических взаимодействий в первую очередь из-за методологических проблем, в том числе способность к их культуре. Это особенно верно для долиолида, Долиолетта гегенбаури. D. gegenbauri обычно встречается в продуктивных субтропических континентальных системах шельфа во всем мире, часто при концентрациях цветения, способных потреблять большую часть суточной первичной продукции. В этом исследовании мы описываем подходы к выращиванию для сбора, выращивания и поддержания D. gegenbauri с целью проведения лабораторных исследований. D. gegenbauri и другие виды doliolid могут быть захвачены жить с помощью косо буксусированных конических 202 мкм сетки планктона сетей с дрейфующего судна. Культуры наиболее надежно устанавливаются, когда температура воды ниже 21 градусов по Цельсию и начинается с незрелых гонозооидов, созревания phorozooids, и большие медсестры. Культуры могут поддерживаться в округлых сосудах культуры на медленно вращающемся колесе планктона и поддерживаться на диете культивированных водорослей в естественной морской воде на протяжении многих поколений. В дополнение к способности устанавливать лабораторные культуры D. gegenbauri, мы демонстрируем, что состояние сбора, концентрация водорослей, температура и воздействие естественно обусловленной морской воды имеют решающее значение для культуры создание, рост, выживание и размножение D. gegenbauri.
Зоопланктон приходится на крупнейших животных биомассы в океане, являются ключевыми компонентами в морских пищевых сетей, и играют важную роль в океане биогеохимических циклов1,2. Зоопланктон, хотя и состоит из огромного разнообразия организмов, можно сильно различать на две категории: желатиновые и нежелатинские с несколькими промежуточными таксонами3,4. По сравнению с нежелатиновым зоопланктоном, желатиновый зоопланктон особеннотрудно изучать из-за их сложной истории жизни 5, и их тонкие ткани легко повреждаются во время захвата и обработки. Gelatinous зоопланктона видов, поэтому, как известно, трудно культуры в лаборатории и в целом менее изучены по сравнению с не-желатиновых видов6.
Среди желатиновых групп зоопланктона, один обильные и экологического значения в мировом океане являются thaliaceans. Талицеаны являются классом пелагических туникатов, которые включают в себя заказы Салпида, Пиросомида, и Долиолида7. Долилида, которую в совокупности называют долиолидами, представляют собой небольшие бочкообразные пелагические организмы, которые могут достигать высокого изобилия в продуктивных неритических регионах субтропических океанов. Долиолиды являются одними из самых распространенных из всех групп зоопланктона4,8. В качестве подвесных фидеров, долиолиды собирают частицы пищи из столбцаводы, создавая фильтровальных токов и захватывая их на слизистых сетях 9. Таксономически, долиолиды классифицируются в phylum Urochordata10. Предки хордатов, и в дополнение к их экологической значимости в качестве ключевых компонентов морских пелагических систем, thaliaceans имеют значение для понимания истоков колониальной истории жизни10,11 и эволюции из хордатов5,7,10,12,13,14.
История жизни долиолидов сложна и вносит свой вклад в трудности в культивирования и поддержания их в течение их жизненного цикла. Обзор полиолид жизненного цикла и анатомии можно найти в Godeaux и др.15. Это долиолидный жизненный цикл, который включает в себя обязательное чередование между сексуальными и бесполыми этапами истории жизни, представлен на рисунке 1. Яйца и сперматозоиды производятся гермафродическими гонозооидами, единственным одиночным этапом жизненного цикла. Gonozooids релиз спермы в колонку воды и яйца внутренне оплодотворены и выпущены развиваться в личинки. Личинки люк и метаморфозы в oozooids, которые могут достигать 1-2 мм. Предполагая благоприятные условия окружающей среды и питания, ooooids стать ранними медсестрами в течение 1-2 дней при 20 градусах Цельсия и инициировать колониальные этапы жизненного цикла. Oozooids бесполым веществом производят почки на их вентральном толоне. Эти почки оставляют столоон и мигрируют в дорсаловый кадофор, где они выстраиваются в три парных ряда. Центральные двойные ряды становят phorozooids и внешние 2 двойных ряда будут trophozooids. Последние обеспечивают питанием как медсестры, так и phorozooids16,17. Трофозуиды снабжают медсестру питанием, так как она теряет все внутренние органы. По мере увеличения численности трофозуидов размер медсестры может достигать 15 мм в лаборатории. По мере того как phorozooids растут, они все больше и больше гладают добычу планктона и достигают й 1.5 мм в размере до быть выпущенным как индивидуалы17. Одна медсестра может выпустить 100 phorozooids в течение своей жизни18. После того, как phorozooids высвобождаются из кадофора, они продолжают расти и являются вторым колониальным этапом жизненного цикла. Как только они достигают 5 мм в размерах, каждый phorozooid развивается кластер gonozooids на их брюшной peduncle. Эти гонозуиды могут глотать частицы, когда они достигают 1 мм в длину. После того, как гонозовиды достигли от 2 до 3 мм в размерах, они высвобождаются из phorozooid и становятся единственной одиночной стадией жизненного цикла. Как только они достигают 6 мм в размерах, gonozooids становятся сексуально зрелыми17. Гонозуиды могут достигать 9 мм и больше в длину. Гонозооиды гермафродические, сперма высвобождается с перерывами, в то время как оплодотворение яйцеклеток происходит внутренне16,17. Когда размер гонозооида составляет 6 мм, он высвобождает до 6 оплодотворенных яйцеклеток. Успешная культивирование требует поддержки конкретных потребностей каждого из этих уникальных этапов истории жизни.
В связи с экологическим и эволюционным значением талицей, в том числе долиолидов, существует необходимость в методах выращивания для продвижения понимания уникальной биологии этого организма, физиологии, экологии и эволюционной истории19 . Долиолиды имеют значительные перспективы в качестве экспериментальных моделей организмов в биологии развития и функциональной геномики, потому что они прозрачны и, вероятно, оптимизированы геномы20,21. Однако отсутствие надежных методов культивирования препятствует их полезности в качестве лабораторных моделей. Хотя несколько лабораторий опубликовали результаты, основанные на культивированных долиолидах, к нашим знаниям подходы к выращиванию и подробные протоколы ранее не публиковались. Основываясь на многолетнем опыте, и проб и ошибок попыток культивирования, цель этого исследования заключается в обзоре опыта и обмена протоколами для сбора и выращивания долиодов, в частности, вид Dolioletta gegenbauri.
За последние несколько десятилетий был создан потенциал в области культуры долиолидов, который использовался для поддержки научных исследований в нескольких областях. Экспериментальные исследования в наших лабораториях поддержали публикацию по крайней мере 15 научных исследований, …
The authors have nothing to disclose.
Мы признательны многим людям, которые внесли накопленные знания в этот проект на протяжении многих лет, включая Г.-А. Паффенхефер и Д. Дейбель, которые первоначально разработали эти протоколы. М. Кёстер и Л. Ламколей также внесли значительный вклад в разработку этих процедур. Н.Б. Лопес-Фигероа и З.Е. Родригес-Сантьяго составили оценки изобилия долиолидов, приведенные в таблице 1. Это исследование было частично поддержано Национальным научным фондом США награды OCE 082599, 1031263 в MEF, совместные проекты OCE 1459293 и OCE 14595010 в MEF и DMG и, Национальное управление океанических и атмосферных наград NA16SEC4810007 DMG. Мы благодарны трудолюбивому и профессиональному экипажу R/V Savannah. Ли Энн DeLeo подготовил цифры, Чарльз И. Робертсон корректир рукописи и, Джеймс (Джимми) Уильямс изготовлены планктона колесо
Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |