Cultivation du Tunicate pélagique marin Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) pour les études expérimentales

Summary

Les doliolides, y compris l’espèce Dolioletta gegenbauri, sont de petits zooplanctonmarins marins gélatineux d’importance écologique que l’on trouve sur les plateaux sous-continentaux productifs du monde entier. La difficulté de cultiver ces organismes délicats limite leur recherche. Dans cette étude, nous décrivons les approches de culture pour la collecte, l’élevage et l’entretien du doliolide Dolioletta gegenbauri.

Abstract

Les zooplanktons gélatineux jouent un rôle crucial dans les écosystèmes océaniques. Cependant, il est généralement difficile d’étudier leur physiologie, leur croissance, leur fécondité et leurs interactions trophiques principalement en raison de défis méthodologiques, y compris la capacité de les culture. Cela est particulièrement vrai pour le doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri se produit généralement dans les systèmes subtropicaux productifs de plateau continental dans le monde entier, souvent à des concentrations de floraison capables de consommer une grande fraction de la production primaire quotidienne. Dans cette étude, nous décrivons des approches de culture pour la collecte, l’élevage et le maintien de D. gegenbauri dans le but de mener des études en laboratoire. D. gegenbauri et d’autres espèces de dolioldes peuvent être capturés vivants à l’aide de filets de plancton à mailles coniques obliquement remorquées de 202 m à partir d’un navire à la dérive. Les cultures sont les plus fiables établies lorsque les températures de l’eau sont inférieures à 21 oC et sont commencées à partir de gonozooides immatures, de phorozooïdes en maturation et de grandes infirmières. Les cultures peuvent être maintenues dans des récipients de culture arrondis sur une roue de plancton tournant lentement et soutenues sur un régime des algues cultivées dans l’eau de mer normale pendant beaucoup de générations. En plus de la capacité d’établir des cultures de laboratoire de D. gegenbauri, nous démontrons que l’état de collecte, la concentration d’algues, la température et l’exposition à l’eau de mer naturellement conditionnée sont tous essentiels à la culture l’établissement, la croissance, la survie et la reproduction de D. gegenbauri.

Introduction

Le compte de zooplancton pour la plus grande biomasse animale dans l’océan, sont des composants clés dans les réseaux alimentaires marins, et jouent un rôle important dans les cycles biogéochimiques océaniques^1,2. Le zooplancton, bien que composé d’une grande diversité d’organismes, peut être grossièrement distingué en deux catégories: gélatineux et non-gélatineux avec peu de taxons intermédiaires^3,4. Comparé au zooplancton non-gélatineux, le zooplancton gélatineux est particulièrement difficile àétudier en raison de leurs histoires de vie complexes 5, et leurs tissus délicats sont facilement endommagés pendant la capture et la manipulation. Les espèces de zooplancton gélatineux sont donc notoirement difficiles à culture en laboratoire et généralementmoins étudiées que les espèces non gélatineuses 6.

Parmi les groupes de zooplancton gélatineux, un abondant et d’importance écologique dans l’océan du monde sont les Thaliacéens. Les Thaliacéens sont une classe de tuniciers pélagiques qui incluent les ordres Salpida, Pyrosomida, et Doliolida⁷. Les Doliolida, collectivement appelées doliolides, sont de petits organismes pélagiques en forme de baril qui peuvent atteindre des abondances élevées dans les régions nerveuses productives des océans subtropicaux. Les doliolides sont parmi les plus abondants de tous les groupes de zooplancton^4,8. En tant que mangeoires de suspension, les doliolides recueillent les particules alimentaires de la colonne d’eau en créant des courants de filtre et en les capturant sur les filets de mucus⁹. Taxonomiquement, les doliolides sont classés dans le phylum Urochordata¹⁰. Ancestral aux chordates, et en plus de leur importance écologique en tant que composants clés des systèmes pélagiques marins, les Thaliacéens sont d’importance pour comprendre les origines de l’histoire de la vie coloniale^10,11 et l’évolution des chordates^{5,7,10,12,13,14}.

L’histoire de la vie des doliolides est complexe et contribue à la difficulté de les cultiver et de les soutenir tout au long de leur cycle de vie. Un examen du cycle de vie et de l’anatomie doliolid peut être trouvé dans Godeaux et autres¹⁵. Le cycle de vie doliolid, qui implique une alternance obligatoire entre les stades de l’histoire de la vie sexuelle et asexuée, est présenté dans la figure 1. Les ovules et le sperme sont produits par les gonozooides hermaphroditiques, la seule étape solitaire du cycle de vie. Les gonozooides libèrent le sperme dans la colonne d’eau et les œufs sont fécondés à l’interne et relâchés pour se développer en larves. Les larves éclosent et se métamorphosent en oozooïdes pouvant atteindre 1 à 2 mm. En supposant des conditions environnementales et une nutrition favorables, les oozooïdes deviennent des infirmières précoces dans un délai de 1 à 2 jours à 20 oC et initient les étapes coloniales du cycle de vie. Les oozooides produisent asexué des bourgeons sur leur stolon ventral. Ces bourgeons quittent le stolon et migrent vers le cadophore dorsal où ils s’alignent en trois rangées jumelées. Les doubles rangées centrales deviennent des phorozooïdes et les deux rangées doubles extérieures deviennent des trophozooïdes. Ces derniers fournissent de la nourriture à la fois à l’infirmière et aux phorozooïdes^16,17. Les trophozooïdes fournissent à l’infirmière de la nutrition car elle perd tous les organes internes. Comme l’abondance des trophozooïdes augmente, la taille de l’infirmière peut atteindre 15 mm en laboratoire. À mesure que les phorozooïdes grandissent, ils ingèrent de plus en plus de proies planctoniques et atteignent 1,5 mm de taille avant d’être relâchés à l’instar de¹⁷individus. Une seule infirmière peut libérer 100 phorozooïdes au cours de sa durée de vie¹⁸. Après que les phorozooïdes sont libérés du cacophore, ils continuent à se développer et sont la deuxième étape coloniale du cycle de vie. Une fois qu’ils atteignent la taille de 5 mm, chaque phorozooid développe un groupe de gonozooides sur leur pédoncule ventral. Ces gonozooides peuvent ingérer des particules lorsqu’elles atteignent 1 mm de longueur. Une fois que les gonozooides ont atteint une taille de 2 à 3 mm, ils sont libérés du phorozooide et deviennent la seule étape solitaire du cycle de vie. Une fois qu’ils atteignent la taille de 6 mm, les gonozooides deviennent sexuellement matures¹⁷. Les gonozooides peuvent atteindre 9 mm ou plus de longueur. Gonozooids sont hermaphroditiques, le sperme est libéré par intermittence tandis que la fécondation des œufs se produit à l’interne^16,17. Lorsque le gonozooid mesure 6 mm, il libère jusqu’à 6 œufs fécondés. La culture réussie exige de soutenir les besoins spécifiques de chacune de ces étapes uniques de l’histoire de la vie.

En raison de l’importance écologique et évolutive des Thaliacéens, y compris les doliolides, il est nécessaire que les méthodologies de culture fassent progresser la compréhension de la biologie, de la physiologie, de l’écologie et de l’histoire évolutive uniques de cet organisme^19. . Les doliolides sont très prometteurs en tant qu’organismes modèles expérimentaux en biologie du développement et en génomique fonctionnelle parce qu’ils sont transparents et ont probablement rationalisé les génomes^20,21. L’absence de méthodes de culture fiables, cependant, empêche leur utilité en tant que modèles de laboratoire. Bien qu’une poignée de laboratoires aient publié des résultats basés sur des doliolides cultivés, nos approches de culture du savoir et nos protocoles détaillés n’ont pas été publiées auparavant. Basé sur des années d’expérience, et des tentatives de culture d’essais et d’erreurs, le but de cette étude était d’examiner les expériences et de partager des protocoles pour la collecte et la culture des doliolides, en particulier l’espèce Dolioletta gegenbauri.

Protocol

1. Préparation des installations de culture pour l’élevage de D. gegenbauri REMARQUE : Tous les matériaux et équipements requis sont répertoriés dans le Tableau des matériaux. Préparer 1 M d’hydroxyde de sodium (NaOH), 0,06 M de permanganate de potassium (KMnO4) solution. Pour préparer cette solution, dissoudre 400 g de NaOH dans 10 L d’eau déionisée. Ajouter 100 g de KMnO4 à la solution NaOH et bien mélanger. Pr?…

Representative Results

Suivant les procédures décrites pour la collecte et la culture du doliolid, D. gegenbauri décrit dans la figure 3, il est possible de maintenir une culture de D. gegenbauri tout au long de son histoire de vie complexe (Figure 1) et le soutenir pendant de nombreuses générations. Bien que la culture de D. gegenbauri soit décrite ici, ces procédures devraient également être pertinentes pour la culture d’autres espèces de doliold…

Discussion

La capacité de culture des doliolides a été établie au cours des dernières décennies et a été utilisée pour soutenir la recherche dans plusieurs domaines. Les études expérimentales dans nos laboratoires ont soutenu la publication d’au moins 15 études scientifiques axées sur l’alimentation et la croissance^18,26, reproduction^18,28, régime^{6, …}

Materials

Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes)	Any	NA	For algal cultures
Autoclave	Any	NA	For sterilizing equipment and seawater for algal cultures
Beakers (2 L glass)	Any	NA	For sorting diluted plankton net tow contents
Buckets (5 gallon, ~20L)	Any	NA	For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use
Carboys (20 L)	Any	NA	For storing seawater
Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap)	Qorpak	GLC-01882	Container for culture
Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap)	Qorpak	GLC-01858	Container for culture
Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber)	Any	NA	To accommodate plankton wheel and culture maintenance
Filtration apparatus for 47 mm filters	Any	NA	For filtering seawater for cultures
Glass microfiber filters, 47 mm	Whatman	1825-047	For filtering seawater for cultures
Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm)	Science Company	NC-10894	Custom cut and edges polished
Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm)	Any	NA	For holding culturing jars to the plankton wheel
Isochrysis galbana strain CCMP1323	National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)	strain CCMP1323	For feeding doliolid cultures
L1 Media Kit, 50 L	National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)	MKL150L	For culturing algae
Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm)	Any	NA	For illuminating doliolids in the jars and beakers
Lighted temperature controlled incubator	Any	NA	For algal cultures
Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl)	Any	NA	For algal cultures
Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and  4 L aquarium cod-end	Sea-Gear Corporation	90-50×5-200-4A/BB	For collecting living doliolids (see Figure 4)
Plankton Wheel	NA	NA	Custom built (see Figure 2)
Plastic wrap	Any	NA	To cover inside of lid of doliolid culture jars
Potassium Permanganate	Fisher Scientific	P279-500	Reagent for cleaning jars and glassware
Rhodomonas sp. strain CCMP740	National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)	strain CCMP740	For feeding doliolid cultures
Rubber Tubing	NA	NA	For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing)
Sodium Bisulfite	Fisher Scientific	S654-500	Reagent for cleaning jars and glassware
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-212	Reagent for cleaning jars and glassware
Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Any	NA	For algal cultures
Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051	National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)	strain CCMP1051	For feeding doliolid cultures
Tissue culture flasks (250 mL)	Any	NA	For algal cultures