Cultivo do Tunicato marinho pelágico Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) para estudos experimentais
Summary
Doliolids, incluindo a espécie Dolioletta gegenbauri, são pequeno zooplâncton marinho gelatinoso de significado ecológico encontrado em sistemas de prateleira subcontinentais produtivos em todo o mundo. A dificuldade de cultivar esses organismos delicados limita sua investigação. Neste estudo, descrevemos abordagens de cultivo para a coleta, criação e manutenção do doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Os e gelatinosos desempenham um papel crucial nos ecossistemas oceânicos. No entanto, é geralmente difícil investigar sua fisiologia, crescimento, fecundidade e interações tróficas, principalmente devido aos desafios metodológicos, incluindo a capacidade de cultura-los. Isto é particularmente verdadeiro para o doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri comumente ocorre em sistemas de prateleira continental subtropical produtiva em todo o mundo, muitas vezes em concentrações de floração capazes de consumir uma grande fração da produção primária diária. Neste estudo, descrevemos abordagens de cultivo para a coleta, criação e manutenção de D. gegenbauri com o objetivo de realizar estudos laboratoriais. D. gegenbauri e outras espécies de doliolid pode ser capturado ao vivo usando obliquamente rebocada cônicos 202 μm malha plâncton redes de um navio à deriva. As culturas são mais confiantemente estabelecidas quando as temperaturas da água estão abaixo de 21 ° c e são iniciadas a partir de gonozooids imaturos, amadurecimento de phorozooids, e grandes enfermeiros. As culturas podem ser mantidas em embarcações de cultura arredondadas em uma roda de plâncton lentamente rotativa e sustentada em uma dieta de algas cultivadas em água do mar natural por muitas gerações. Além da capacidade de estabelecer culturas laboratoriais de D. gegenbauri, demonstramos que a condição de coleta, a concentração de algas, a temperatura e a exposição à água do mar naturalmente condicionada são essenciais para a cultura estabelecimento, crescimento, sobrevivência e reprodução de D. gegenbauri.
Introduction
Zooplâncton conta para a maior biomassa animal no oceano, são componentes-chave em Webs de alimentos marinhos, e desempenham papéis importantes no oceano biogeoquímica ciclos1,2. O zooplâncton, embora constituído por uma enorme diversidade de organismos, pode ser distinguido grosseiramente em duas categorias: gelatinosa e não-gelatinosa com poucos táxons intermediários3,4. Comparado com o zooplâncton não-gelatinoso, o zooplâncton gelatinoso é especialmente difícil de estudar por causa de suas complexas histórias de vida5, e seus tecidos delicados são facilmente danificados durante a captura e manuseio. As espécies de zooplâncton gelatinosas são, portanto, notoriamente difíceis de cultura em laboratório e geralmente menos estudadas em comparação com espécies não gelatinosas6.
Entre os grupos gelatinosos do zooplâncton, um abundante e de importância ecológica no oceano do mundo são os Thaliaceans. Thaliaceans são uma classe de tunicados pelágicos que incluem as ordens salpida, pyrosomida, e doliolida7. Doliolida, coletivamente referidos como doliolids, são pequenos organismos pelágicos livres de natação em forma de barril que podem atingir altas abundâncias em regiões nerióticas produtivas de oceanos subtropicais. Doliolids estão entre os mais abundantes de todos os grupos zooplâncton4,8. Como alimentadores de suspensão, os os coletam partículas de alimento da coluna de água criando correntes filtrantes e capturando-as em redes de muco9. Taxonomicamente, os os são classificados no filo Urochordata10. Ancestral dos chordates, e além de seu significado ecológico como componentes-chave dos sistemas marinhos pelágicos, os Taliaceanos são de importância para a compreensão das origens da história da vida colonial10,11e da evolução dos Cordados5,7,10,12,13,14.
A história de vida dos os é complexa e contribui para a dificuldade em cultivá-los e sustentá-los através do seu ciclo de vida. Uma revisão do ciclo de vida e da anatomia do doliolid pode ser encontrada em Godeaux et al.15. O ciclo de vida doliolid, que envolve uma alternância obrigatória entre estágios sexuais e assexuais da história da vida, é apresentado na Figura 1. Os ovos e o esperma são produzidos pelos gonozooids hermafroditas, o único estágio solitário do ciclo de vida. Gonozooids liberar esperma para a coluna de água e os ovos são fertilizados internamente e liberados para se desenvolverem em larvas. Larvas eclodir e metamorfose em oozooids que podem chegar a 1-2 mm. presumindo condições ambientais propícias e nutrição, oozooids tornam-se enfermeiros precoces dentro de 1-2 dias a 20 ° c e iniciam as fases coloniais do ciclo de vida. Oozooids produzem brotos assexualmente em seu stolon ventral. Estes botões deixam o estolão e migram para o cadóforo dorsal onde se alinham em três fileiras emparelhadas. As fileiras dobro centrais transformam-se designados e as duas fileiras dobro exteriores transformam-se trophozooids. Estes últimos fornecem alimentos tanto para o enfermeiro quanto para os designados16,17. Os trophozooids fornecem a enfermeira a nutrição enquanto perde todos os órgãos internos. Como a abundância de trophozooids aumenta, o tamanho do enfermeiro pode chegar a 15 mm no laboratório. À medida que os designados crescem, cada vez mais ingerem presas planktónicas e atingem ~ 1,5 mm de tamanho antes de serem liberados como indivíduos17. Uma única enfermeira pode liberar > 100 designados durante sua vida útil18. Depois que os designados são liberados do cadophore, continuam a crescer e são a segunda etapa colonial do ciclo de vida. Uma vez que alcangam ~ 5 milímetros no tamanho, cada phorozooid desenvolve um conjunto de gonozóoides em seu pedúnculo ventral. Estes gonozooides podem ingerir partículas quando atingem ~ 1 mm de comprimento. Depois que os gonozóoides alcangaram ~ 2 a 3 milímetros no tamanho são liberados do phorozooid e transformam-se o único estágio solitário do ciclo de vida. Uma vez que alcançam ~ 6 milímetros no tamanho, os gonozóoides tornam-se sexualmente maduros17. Gonozooids pode atingir 9 mm ou maior de comprimento. Gonozooids são hermafroditas, o espermatozóide é liberado intermitentemente enquanto a fertilização dos ovos ocorre internamente16,17. Quando o gonozooide é ≥ 6 mm de tamanho, ele libera até 6 ovos fertilizados. A cultura bem-sucedida requer o suporte às necessidades específicas de cada um desses estágios de história de vida únicos.
Devido ao significado ecológico e evolutivo de Thaliaceans, incluindo doliolids, há uma necessidade para as metodologias de cultivo para avançar o entendimento da biologia, fisiologia, ecologia e história evolutiva do único organismo19 . Os doliolids têm uma promessa considerável como organismos modelo experimentais em biologia do desenvolvimento e genômica funcional porque são transparentes e provavelmente têm genomas simplificados20,21. A falta de métodos de cultivo confiáveis, no entanto, impede sua utilidade como modelos laboratoriais. Embora um punhado dos laboratórios publiquem resultados baseados em doliolids cultivados, a nossas aproximações do cultivo do conhecimento e os protocolos detalhados não estiveram publicados previamente. Com base em anos de experiência e tentativas de cultivo experimental e de erro, o objetivo deste estudo foi revisar experiências e compartilhar protocolos para a coleta e cultivo de doliolids, especificamente a espécie Dolioletta gegenbauri.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade de cultura os tem sido estabelecida ao longo das últimas décadas e tem sido utilizada para apoiar a investigação em várias áreas. Estudos experimentais em nossos laboratórios têm apoiado a publicação de pelo menos 15 estudos científicos focados na alimentação e crescimento18,26, reprodução18,28, dieta6, 29, fisiologia<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos às muitas pessoas que contribuíram com o conhecimento acumulado para este projeto ao longo dos anos, incluindo a G.-A. Paffenhöfer e D. Deibel que desenvolveram originalmente estes protocolos. M. Köster, e L. Lamboley também contribuíram significativamente para o desenvolvimento desses procedimentos. N.B. López-Figueroa e Á.ee Rodríguez-Santiago geraram as estimativas de abundância de doliolid fornecidas na tabela 1. Este estudo foi apoiado em parte pela Fundação Nacional de ciência dos EUA concede OCE 082599, 1031263 para MEF, projetos colaborativos OCE 1459293 e OCE 14595010 para MEF e DMG e, o Prêmio Nacional de administração oceânica e atmosférica NA16SEC4810007 a DMG. Somos gratos à equipe trabalhadora e profissional do R/V Savannah. Lee Ann DeLeo preparou as figuras, Charles Y. Robertson revisou o manuscrito e, James (Jimmy) Williams fabricou a roda de plâncton
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
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