زراعة البحرية التونيكات دوليوليتا gegenbauri (Uljanin 1884) للدراسات التجريبية
Summary
Doliolids، بما في ذلك الأنواع Dolioletta gegenbauri، هي العوالق الحيوانية البحرية الجيلاتينية الصغيرة ذات الأهمية الإيكولوجية الموجودة على نظم الجرف شبه القارية المنتجة في جميع أنحاء العالم. صعوبة زراعة هذه الكائنات الحساسة تحد من تحقيقها. في هذه الدراسة، ونحن نصف نهج زراعة لجمع وتربية، والحفاظ على doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
تلعب العوالق الحيوانية الجيلاتينية دوراً حاسماً في النظم الإيكولوجية للمحيطات. ومع ذلك، فمن الصعب عموما للتحقيق في علم وظائف الأعضاء، والنمو، والخصوبة، والتفاعلات الغذائية ويرجع ذلك في المقام الأول إلى التحديات المنهجية، بما في ذلك القدرة على ثقافتهم. وهذا ينطبق بشكل خاص على دوليوليد، دوليوليتا غيغنبوري. D. gegenbauri يحدث عادة في نظم الجرف القاري شبه الاستوائية المنتجة في جميع أنحاء العالم، وغالبا ما يكون في تركيزات ازهر قادرة على استهلاك جزء كبير من الإنتاج الأولي اليومي. في هذه الدراسة، نقوم بوصف نُهج الزراعة لجمع وتربية وصيانة D. gegenbauri لغرض إجراء دراسات مختبرية. D. gegenbauri وغيرها من الأنواع doliolid يمكن التقاطها على الهواء مباشرة باستخدام شبكات العوالق المخروطية قطرها بشكل غير مباشر 202 م من سفينة عائمة. يتم تأسيس الثقافات بشكل موثوق به عندما تكون درجات حرارة المياه أقل من 21 درجة مئوية وتبدأ من الغونوزويد غير ناضجة، وphorozooids النضج، والممرضات الكبيرة. ويمكن الحفاظ على الثقافات في أوعية الثقافة المستديرة على عجلة العوالق الدوارة ببطء والحفاظ عليها على نظام غذائي من الطحالب المستزرعة في مياه البحر الطبيعية لأجيال عديدة. بالإضافة إلى القدرة على إنشاء الثقافات المختبرية من D. gegenbauri،ونحن نثبت أن حالة جمع، تركيز الطحالب، ودرجة الحرارة، والتعرض لمياه البحر مكيفة بشكل طبيعي كلها حاسمة للثقافة إنشاء, النمو, البقاء على قيد الحياة, واستنساخ D. gegenbauri.
Introduction
تمثل العوالق الحيوانية أكبر كتلة حيوية حيوانية في المحيط، وهي مكونات رئيسية في شبكات الأغذية البحرية، وتلعب أدوارا هامة في الدورات البيوجيوكيميائية للمحيطات1و2. العوالق الحيوانية، على الرغم من أنها تتألف من تنوع كبير من الكائنات الحية، يمكن تمييزها بشكل صارخ في فئتين: الجيلاتين وغير الجيلاتينمع عدد قليل من الضريبة المتوسطة3،4. بالمقارنة مع العوالق الحيوانية غير الجيلاتينية، العوالق الحيوانية الجيلاتينية من الصعب بشكل خاص لدراسة بسبب تاريخها الحياة المعقدة5، وتلف الأنسجة الحساسة بسهولة أثناء التقاط والتعامل معها. أنواع العوالق الحيوانية الجيلاتينية، وبالتالي، من الصعب على نحو سيء السمعة للثقافة في المختبر وعموما أقل دراسة بالمقارنة مع الأنواع غير الجيلاتينية6.
ومن بين مجموعات العوالق الحيوانية الجيلاتينية، هناك مجموعة وفيرة وذات أهمية إيكولوجية في محيط العالم هي التالياسيين. Thaliaceans هي فئة من التونيكات البحرية التي تشمل أوامر سالبيدا، بيروسوميدا، وDoliolida7. وDoliolida، التي يشار إليها مجتمعة باسم الدوليوليدات، هي كائنات بحرية صغيرة على شكل برميل سباحة حرة يمكن أن تصل إلى وفرة عالية في المناطق النِرية المنتجة للمحيطات شبه المدارية. Doliolids هي من بين الأكثر وفرة من جميع مجموعات العوالق الحيوانية4،8. كما مغذيات التعليق، doliolids جمع جزيئات الطعام من عمود الماء عن طريق خلق تيارات فلتر والتقاطها على شبكات المخاط9. تصنيف هادليوليدات في فيلوم أوروخورداتا10. الأجداد إلى الجوقة، وبالإضافة إلى أهميتها الإيكولوجية كمكونات رئيسية للنظم البحرية البحرية، Thaliaceans هي ذات أهمية لفهم أصول تاريخ الحياة الاستعمارية10،11 والتطور من الجوقة5،7،10،12،13،14.
تاريخ حياة doliolids معقد ويسهم في صعوبة في زراعة والحفاظ عليها من خلال دورة حياتهم. ويمكن الاطلاع على استعراض لدورة حياة دولوليد والتشريح في Godeaux وآخرون15. دورة حياة دولوليد، التي تنطوي على التناوب الإلزامي بين مراحل الحياة الجنسية وغير الجنسية تاريخ الحياة، وترد في الشكل 1. يتم إنتاج البيض والحيوانات المنوية من قبل gonozooids hermaphroditic، المرحلة الانفرادية الوحيدة من دورة الحياة. تطلق الحيوانات المنوية من الغونوزويد إلى عمود الماء ويتم تخصيب البويضات داخلياً وإطلاقها لتصبح يرقات. تفقس اليرقات وتتحول إلى oozooids التي يمكن أن تصل إلى 1-2 ملم. الأوزويد تنتج براعم غير جنسية على stolon البطني. هذه البراعم ترك stolon والهجرة إلى cadophore الظهرية حيث يصطفون في ثلاثة صفوف مقترنة. يصبح الصفوف مركزية مزدوجة [فوروزويدس] والخارجيّة اثنان صفوف مزدوجة يصبح [تروبهوزويدس]. هذا الأخير توفير الغذاء لكل من الممرضة وphorozooids16،17. التروبهوزويد تزود الممرضة بالتغذية لأنها تفقد جميع الأعضاء الداخلية. مع زيادة وفرة التروبهوزويد ، يمكن أن يصل حجم الممرضة إلى 15 مم في المختبر. كما تنمو phorozooids، فإنها بتزايد تناول فريسة العوالق وتصل إلى ~ 1.5 ملم في الحجم قبل أن يطلق سراحه كأفراد17. ممرضة واحدة قد تطلق سراح > 100 phorozooids خلال عمرها18. بعد أن يتم تحرير phorozooids من cadophore، فإنها لا تزال تنمو وهي المرحلة الاستعمارية الثانية من دورة الحياة. بمجرد أن تصل إلى حوالي 5 ملم في الحجم، كل phorozooid يطور مجموعة من الغونوزويد على peduncle البطني. هذه gonozooids يمكن تناول الجسيمات عندما تصل إلى ~ 1 ملم في الطول. بعد أن وصلت gonozooids ~ 2 إلى 3 ملم في الحجم يتم الإفراج عنهم من phorozooid وتصبح المرحلة الانفرادية الوحيدة من دورة الحياة. بمجرد أن تصل إلى ~ 6 ملم في الحجم، gonozooids تصبح ناضجة جنسيا17. يمكن أن تصل الغونوزويد إلى 9 مم أو أكثر في الطول. Gonozooids هي hermaphroditic ، يتم تحرير الحيوانات المنوية بشكل متقطع في حين أن تخصيب البيض يحدث داخليا16،17. عندما يكون الغونوزويد ≥ 6 مم في الحجم، فإنه يطلق ما يصل إلى 6 البيض المخصبة. يتطلب النجاح في الزراعة دعم الاحتياجات المحددة لكل مرحلة من مراحل تاريخ الحياة الفريدة هذه.
نظراً للأهمية الإيكولوجية والتطورية للثالياسيين، بما في ذلك الدوليوليدات، هناك حاجة لمنهجيات الزراعة لتعزيز فهم البيولوجيا الفريدة لهذا الكائن الحي، وعلم وظائف الأعضاء، والإيكولوجيا، والتاريخ التطوري19 . Doliolids لديها وعد كبير ككائنات نموذجية تجريبية في البيولوجيا التنموية وعلم الجينوم الوظيفي لأنها شفافة ومن المرجح أن تكون الجينومات مبسطة20،21. غير أن الافتقار إلى أساليب زراعة موثوقة يعوق فائدتها كنماذج مختبرية. على الرغم من أن حفنة من المختبرات قد نشرت نتائج على أساس doliolids المستزرعة، لم يتم نشر نهج زراعة المعرفة لدينا والبروتوكولات التفصيلية من قبل. استنادا إلى سنوات من الخبرة، ومحاولات زرع التجربة والخطأ، وكان الغرض من هذه الدراسة لاستعراض الخبرات وتبادل بروتوكولات لجمع وزراعة doliolids، وعلى وجه التحديد الأنواع Dolioletta gegenbauri.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أنشئت القدرة على تربية الدوليوليدات على مدى العقود العديدة الماضية واستخدمت لدعم البحوث في عدة مجالات. وقد دعمت الدراسات التجريبية في مختبراتنا نشر ما لا يقل عن 15 دراسة علمية تركز على التغذية والنمو18،26، الاستنساخ18،28، ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للعديد من الأشخاص الذين ساهموا بالمعرفة المتراكمة في هذا المشروع على مر السنين بما في ذلك G.-A. Paffenhöfer وD. Deibel الذين وضعوا أصلا هذه البروتوكولات. كما ساهم السيد كوستر وإل لامبولي مساهمة كبيرة في تطوير هذه الإجراءات. ونتج عن كل من ن. ب. لوبيز – فيغيروا وأي إ. رودريغيز – سانتياغو تقديرات وفرة الدوليوليد الواردة في الجدول 1. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم جزئي من جوائز المؤسسة الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة OCE 082599 و1031263 إلى MEF، والمشاريع التعاونية OCE 1459293 وOCE 14595010 إلى الوزارة وشركة DMG، وجائزة الإدارة الوطنية لدراسة المحيطات والغلاف الجوي NA16SEC4810007 إلى DMG. ونحن ممتنون للطاقم الكادح والمهنية من السافانا R / V. لي آن ديليو أعدت الأرقام، تشارلز ي. روبرتسون التدقيق المخطوطة، وجيمس (جيمي) وليامز تصنيع عجلة العوالق
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
- Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous?. American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean’s minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D., Bone, Q. . The biology of pelagic tunicates. , 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
