実験研究のための海洋ペラジック・チュニケート・ドリオレッタ・ゲゲンバウリ(ウルジャニン1884)の栽培
Summary
ドリオレッタゲゲンバウリ種を含むドリオリッドは、世界中の生産的な亜大陸棚システムに見られる生態学的意義の小さなゼラチン状の海洋動物プランクトンです。これらの繊細な生物を培養することの難しさは、彼らの調査を制限します。本研究では、ドリオリッド・ドリオレッタ・ゲゲンバウリを収集、飼育、維持するための栽培アプローチについて述べた。
Abstract
ゼラチン状の動物プランクトンは、海洋生態系において重要な役割を果たしています。しかし、一般的に、生理学、成長、性感、栄養相互作用を調べることは、主に培養能力を含む方法論的な課題に起因する。これは特にドリオリッド、ドリオレッタゲゲンバウリに当てはまります。D. ゲゲンバウリは、一般的に世界中の生産的な亜熱帯大陸棚システムで発生し、多くの場合、毎日の一次生産の大部分を消費することができるブルーム濃度で発生します。本研究では、実験室ベースの研究を行う目的で、D.ゲゲンバウリを収集、飼育、維持するための栽培アプローチについて述べた。D.ゲゲンバウリおよび他のドリオリッド種は、漂流船から斜めに牽引された円錐形202μmメッシュプランクトンネットを使用して生きて捕獲することができる。水温が21°Cを下回り、未熟なゴノズーイド、成熟したハロゾイド、および大きな看護師から始まる培養物は、最も確実に確立されます。培養は、ゆっくりと回転するプランクトンホイール上の丸みを帯びた培養船で維持され、何世代にもわたって天然海水で培養藻類の食事に維持することができます。D.ゲゲンバウリの実験室培養を確立する能力に加えて、我々は、採取条件、藻類濃度、温度、および自然条件付き海水への暴露がすべて文化にとって重要であることを実証する。D.ゲゲンバウリの確立、成長、生存、および再生。
Introduction
海洋で最大の動物バイオマスを占める動物プランクトンは、海洋食物網の重要な構成要素であり、海洋生物地球化学サイクル1、2において重要な役割を果たしている。動物プランクトンは、生物の巨大な多様性で構成されているが、ゼラチン状と非ゼラチン性の2つのカテゴリーに大きく区別することができる:少数の中間タキサ3、4とゼラチン状。非ゼラチン性動物プランクトンと比較して、ゼラチン状の動物プランクトンは、その複雑な生命史5のために研究することは特に困難であり、その繊細な組織は捕獲および取り扱いの間に容易に損傷を受ける。ゼラチン性動物プランクトン種は、したがって、実験室で培養することが悪名高く、一般的に非ゼラチン種6と比較して研究が少ない。
ゼラチン状の動物プランクトン群の中で、世界の海洋における生態学的重要性の1つがタリア人である。サリアセアンは、サルピダ、ピロソミダ、およびドリオリダ7の命令を含むペラジックチュニケートのクラスです。ドリオリダは、総称してドリオリッドと呼ばれ、亜熱帯海洋の生産的な神経領域で高い豊富に達することができる小さなバレル状の自由水泳ペラジック生物です。ドリオリッドは、すべての動物プランクトングループの中で最も豊富なの一つである4、8.懸濁フィーダーとして、ドリオリッドは、フィルター電流を作成し、粘液ネット9上でそれらを捕捉することにより、水柱から食品粒子を収集します。分類的には、ドリオリッドは、フィルムウロホボルデータ10に分類される。タリアテスの祖先、および海洋ペラジック系の主要な構成要素としての生態学的意義に加えて、タリアセアンは植民地時代の生命史10、11および進化の起源を理解する上で重要である。コードの5,7,10,12,13,14.
ドリオリッドの人生の歴史は複雑であり、彼らのライフサイクルを通じてそれらを培養し、維持することの難しさに貢献しています。ドリウリッドのライフサイクルと解剖学のレビューは、Godeauxら15で見つけることができます.性的および無性の生命史段階の間の義務的な交互を伴うドリオリッドのライフサイクルは、図1に示される。卵子と精子は、ライフサイクルの唯一の孤独な段階であるヘルマフロジティック・ゴノズーイドによって産生される。Gonozooidsは水柱に精子を放出し、卵子は内部受精し、幼虫に成長するために放出される。幼虫の孵化と変態は、1〜2ミリメートルに達することができるウーズイドに変身し、環境条件と栄養を仮定すると、oozooidは20°Cで1〜2日以内に早期看護師となり、ライフサイクルの植民地段階を開始します。ウーズーイドは、腹部のストロンに芽を性的に産生する。これらの芽は、ストロンを残し、彼らは3つのペアの行に並んで後部カドフォアに移行します。中央の二重行はホロズーイドになり、外側の2つの二重列はトロフォズーイドになります。後者は、看護師とフォロズイド16、17の両方に食べ物を提供します。トロフォズーイドは、彼女がすべての内臓を失うように栄養を看護師に供給します。トロフォズイドの豊富さが増加するにつれて、看護師のサイズは実験室で15ミリメートルに達することができます。ハロズイドが成長するにつれて、彼らはますますプランクトンの獲物を摂取し、個人17として放出される前に約1.5ミリメートルの大きさに達する。単一の看護師は、その寿命18の間に>100のフォロズーイドを解放するかもしれません。ハロゾードがカドフォアから放出された後、彼らは成長し続け、ライフサイクルの第二の植民地段階です。彼らはサイズが〜5ミリメートルに達すると、各フォロズーイドは、彼らの腹部のペダンクル上のゴノズーイドのクラスターを開発します。これらのゴノズーイドは、長さが約1mmに達すると粒子を摂取することができます。gonozooidsが2〜3ミリメートルの大きさに達した後、彼らはフォロズイドから解放され、ライフサイクルの唯一の孤独な段階になります。彼らはサイズが〜6ミリメートルに達すると、gonozooidは性的に成熟した17になります。ゴノズーイドは9mm以上の長さに達することができます。ゴノズーイドは、ヘルマフロジティックであり、精子は卵子の受精が内部的に起こる間断続的に放出される16、17である。ゴノズーイドの大きさが≥6mmの場合、それは6個まで受精卵を放出する。培養を成功させるには、これらのユニークなライフヒストリーステージのそれぞれに固有のニーズをサポートする必要があります。
ドリオリッドを含むタリアセアンの生態学的、進化的意義により、この生物の固有の生物学、生理学、生態学、進化史の理解を進めるための栽培方法論が必要である19.ドリオリッドは、発生生物学および機能的ゲノミクスにおける実験モデル生物としてかなりの期待を持っている。しかし、信頼性の高い栽培方法の欠如は、実験室モデルとしての有用性を阻害する。少数の研究室が培養ドリオリッドに基づいて結果を発表しているが、我々の知識栽培アプローチと詳細なプロトコルは以前に発表されていない。長年の経験と試行錯誤の栽培の試みに基づいて、この研究の目的は、経験を見直し、ドリオリッドの収集と栽培のためのプロトコルを共有することであった, 特に種ドリオレッタゲゲンバウリ.
Protocol
Representative Results
Discussion
ドリオリッドを培養する能力は、過去数十年にわたって確立され、いくつかの分野での研究を支援するために使用されています。私たちの研究室での実験的研究は、摂食と成長に焦点を当てた少なくとも15の科学的研究の出版をサポートしています18,26, 生殖18,28, 食事6, <sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.Aを含め、長年にわたりこのプロジェクトに蓄積された知識を提供してくださった多くの方々に感謝しています。もともとこれらのプロトコルを開発したパフェンホーファーとD.デイベル。M.ケスターとL.ランボリーはまた、これらの手順の開発に大きく貢献しています。 N.B.ロペス・フィゲロアとロドリゲス・サンティアゴは、表1に提供されるドリオリッドの豊富さの推定値を生成しました。この研究は、米国国立科学財団賞OCE 082599、MEFへの1031263、MEFとOCE 14595010の共同プロジェクト、およびMEFとDMGへの米国海洋大気庁賞NA16SEC4810007によって一部支持されました。私たちは、R/Vサバンナの勤勉で専門的な乗組員に感謝しています。リー・アン・デレオがフィギュアを用意し、チャールズ・Y・ロバートソンが原稿を校正し、ジェームズ(ジミー)ウィリアムズがプランクトンホイールを製作
Materials
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow – should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50×5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
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