Summary

Análisis de análogos de ácido iophenoxic en pequeña mangosta india (Herpestes Auropunctatus) Sera para su uso como un marcador biológico de vacunación de rabia oral

Published: May 31, 2019
doi:

Summary

Ofrecimos mongooses placebo cebos de vacuna de rabia oral con ácido etil o metilio-ifenoxico como biomarcador y verificamos la aceptación de cebos utilizando una novedosa cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) método.

Abstract

La pequeña mangosta india (Herpestes auropunctatus) es un reservorio del virus de la rabia (RABV) en Puerto Rico y comprende más del 70% de los casos de rabia animal reportados anualmente. El control de la circulación rabosa en los embalses de vida silvestre se logra típicamente mediante una estrategia de vacunación oral contra la rabia (ORV). Actualmente no existe ningún programa de ORV de vida silvestre en Puerto Rico. Se han llevado a cabo investigaciones sobre vacunas orales contra la rabia y varios tipos de cebos para la mangosta sin demonios con resultados prometedores. El monitoreo del éxito del ORV se basa en la estimación de la aceptación de cebos por especies objetivo, lo que normalmente implica evaluar un cambio en los anticuerpos neutralizantes rabv (RVNA) después de la vacunación. Esta estrategia puede ser difícil de interpretar en áreas con un programa activo de ORV de vida silvestre o en áreas donde RABV es enzoótico y los niveles de fondo de RVNA están presentes en las especies de reservorios. En tales situaciones, un biomarcador incorporado con la vacuna o la matriz de cebo puede ser útil. Ofrecemos 16 cebos orV placebo de mangostas cautivas que contienen ácido etil-iofenoxic (et-IPA) en concentraciones de 0.4% y 1% dentro del cebo y 0.14% en la matriz de cebo externo. También ofrecimos 12 cebos ORV de mangostas cautivas que contienen ácido metil-iofenoxic (me-IPA) en concentraciones de 0.035%, 0.07% y 0.14% en la matriz de cebo externo. Recogimos una muestra de suero antes de la oferta de cebo y luego semanalmente hasta ocho semanas después de la oferta. Extrajimos ácidos iofenoxicos de los sueros en acetonitrilo y cuantificamos mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas. Analizamos los sueros para et-IPA o me-IPA por cromatografía líquida-espectrometría de masas. Encontramos una capacidad de marcado adecuada durante al menos ocho y cuatro semanas para et- y me-IPA, respectivamente. Ambos derivados del IPA podrían ser adecuados para la evaluación sobre el terreno de la ingesta de cebo ORV en mangostas. Debido a la longevidad del marcador en la mangosta sera, se debe tener cuidado de no confundir los resultados mediante el uso de la misma derivada IPA durante evaluaciones consecutivas.

Introduction

El virus de la rabia (RABV) es un lyssavirus de una sola cadena de sentido negativo, y circula entre diversas especies de embalses de vida silvestre dentro de los órdenes Carnivora y Chiroptera. Múltiples especies de mangosta son reservorios de RABV, y la pequeña mangosta india (Herpestes auropunctatus) es el único reservorio en Puerto Rico y otras islas del Caribe en el hemisferio occidental1,2,3 . El control de la circulación rabosa en los embalses de vida silvestre se realiza típicamente a través de una estrategia de vacunación oral contra la rabia (ORV). En los Estados Unidos (EE.UU.), esta actividad de gestión está coordinada por el Programa Nacional de Gestión de La Rabia (NRMP)4del USDA/APHIS/Wildlife Services. Actualmente no existe ningún programa de ORV de vida silvestre en Puerto Rico. Se ha llevado a cabo investigaciones sobre vacunas antirrábicas y varios tipos de cebos para mangostas con resultados prometedores que sugieren que un programa de ORV para mangostas es posible5,6,7,8.

El monitoreo del impacto de la ORV se basa en la estimación de la aceptación del cebo por especies objetivo, lo que normalmente implica evaluar un cambio en la seroprevalencia de anticuerpos RV. Sin embargo, esta estrategia puede ser difícil en áreas con un programa activo de ORV de vida silvestre o en áreas donde rv es enzoótico y los niveles de fondo de anticuerpos neutralizantes RABV (RVNA) están presentes en las especies de reservorios. En tales situaciones, un biomarcador incluido en el cebo o la matriz de cebo externa puede ser útil.

Varios marcadores biológicos se han utilizado para monitorear la adopción de cebos en numerosas especies, incluyendo mapaches (Procyon lotor)9,10,stoats (Mustela ermine)11,12, tejones europeos ( Meles meles) 13, jabalíes (Sus scrofa)14, pequeñas mangostas indias15 y perros de la pradera (Cynomysludovicianus)16,17, entre otros. En los Estados Unidos, los cebos ORV operativos a menudo incluyen un biomarcador de tetraciclina del 1% en la matriz de cebos para monitorear la toma de cebo18,19. Sin embargo, los inconvenientes en el uso de la tetraciclina incluyen una creciente preocupación por la distribución de antibióticos en el medio ambiente y que la detección de tetraciclina es típicamente invasiva, lo que requiere la extracción dental o la destrucción del animal para obtener hueso muestras20. Rhodamine B ha sido evaluado como un marcador en una variedad de tejidos y se puede detectar utilizando luz ultravioleta (UV) y fluorescencia en el cabello y bigotes10,21.

El ácido iofenoxic (IPA) es un polvo blanco y cristalino que se ha utilizado para evaluar el consumo de cebo en coyotes (Canis latrans)22, zorro ártico (Vulpes lagopus)23, zorro rojo (Vulpes vulpes)24, mapaches 9 , 25, jabalí14, venado rojo (Cervus elaphus scoticus)26, tejones europeos12 y hurones (M. furo)27, entre varias otras especies de mamíferos. Los tiempos de retención de IPA varían según la especie de menos de dos semanas en algunos marsupiales28,29, a al menos 26 semanas en ungulados26 y más de 52 semanas en perros domésticos (Canis lupus familiaris)30. Los tiempos de retención también pueden depender de la dosis31. El ácido iofenoxico se une fuertemente a la albúmina sérica y fue detectado históricamente por la medición de los niveles de yodo en sangre32. Este enfoque indirecto fue suplantado por métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para medir directamente las concentraciones de ácido crianoxórico con detección UV33,y finalmente con cromatografía líquida y espectrometría de masas (LCMS) 34,35. Para este estudio, se desarrolló un método de cromatografía líquida altamente sensible y selectiva con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) que utiliza monitoreo de reacción múltiple (MRM) para cuantificar dos análogos del ácido iofenoxico. Nuestro objetivo era utilizar este método LC-MS/MS para evaluar la capacidad de marcado de ácido 2-(3-hidroxi-2,4,6-triiodobenzyl)propanoico (metil-IPA o me-IPA) y 2-(3-hidroxi-2,4,6-triiodobenzyl)ácido butanoico (etil-IPA o et-IPA) y cuando se entrega en un ORV (etil-IPA o et-IPA) y cuando se entrega en un ORV (etil-IPA o et-IPA) y cuando se entrega en un ORV cebo a las mangostas cautivas.

Las mangostas fueron capturadas en vivo en trampas de jaulas con salchichas ahumadas disponibles en el mercado y aceite de pescado. Las mangostas se alojaban en jaulas individuales de acero inoxidable de 60 cm x 60 cm x 40 cm y alimentaban una ración diaria de 50 g de comida seca para gatos, complementada dos veces por semana con un muslo de pollo disponible en el comercio. El agua estaba disponible ad libitum. Entregamos dos derivados de IPA, etil-IPA y metil-IPA, a mangostas cautivas en cebos ORV placebo. Todos los cebos estaban compuestos por un blíster de lámina de 28 mm x 20 mm x 9 mm con un recubrimiento externo (en adelante “matriz de cebo”) que contiene huevo de pollo en polvo y gelatina (Tabla de materiales). Los cebos contenían 0,7 ml de agua o derivado de IPA y pesaban aproximadamente 3 g, de los cuales 2 g era la matriz de cebo externa.

Ofrecimos 16 mangostas cautivas y-IPA en tres concentraciones: 0,14% (2,8 mg et-IPA en matriz de cebo de 2 g; 3 machos [m], 3 hembras [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA en 0,7 ml de volumen de envase blíster; 3 m, 3f) y 1,0% (7,0 mg de etil-IPA en 0,7 ml de volumen de blíster; , 2f). La dosis global de 2,8 mg corresponde a una dosis de 5 mg/kg27,36 y se basa en un peso medio de mangosta de 560 g en Puerto Rico. Seleccionamos el 1% como la concentración más alta como la investigación sugiere que la aversión al sabor a algunos biomarcadores puede ocurrir en concentraciones >1% en algunas especies37. Sólo ofrecimos la dosis del 1% en el blíster, ya que la floculación impidió que el soluto se disolviera en el disolvente lo suficiente como para incorporarse uniformemente a la matriz de cebo. Un grupo de control (2m, 1f) recibió cebos llenos de agua estéril y sin IPA. Ofrecimos cebos a las mangostas por la mañana (8 a.m.) durante o antes de alimentar su ración de mantenimiento diario. Los restos de cebo fueron retirados después de aproximadamente 24 horas. Recogimos muestras de sangre antes del tratamiento, un día después del tratamiento y luego semanalmente hasta 8 semanas después del tratamiento. Hemos anestesiado las mangostas por inhalación de gas isoflurano y recolectamos hasta 1,0 ml de sangre entera por venopunción de la vena cava craneal como se describe para hurones38. Centrifugamos muestras de sangre entera, transferimos sueros a crioviales y las almacenamos a -80 oC hasta su análisis. No todos los animales fueron muestreados durante todos los períodos de tiempo para minimizar los impactos de las extracciones repetidas de sangre en la salud de los animales. Los animales de control se tomaron muestras el día 0, luego semanalmente hasta 8 semanas después del tratamiento.

Entregamos me-IPA en tres concentraciones: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) y 0,14% (2,8 mg), todo ello incorporado a la matriz de cebo, con 2 machos y 2 hembras por grupo de tratamiento. Dos machos y dos hembras recibieron cebos llenos de agua estéril y sin IPA. Los tiempos de ofrenda de cebo y la anestesia de mangosta se describen anteriormente. Recogimos muestras de sangre antes del tratamiento el día 1, y luego semanalmente hasta 4 semanas después del tratamiento.

Probamos los datos de concentración sérica para la normalidad y los medios estimados para las concentraciones séricas de IPA de diferentes grupos de tratamiento. Utilizamos un modelo mixto lineal para comparar las concentraciones medias de suero y IPA agrupadas entre individuos. El tipo de cebo (matriz/blister pack) era un efecto fijo además del día experimental, mientras que la identificación animal era un efecto aleatorio. Todos los procedimientos se ejecutaron utilizando un software estadístico común (Tablade materiales)y la importancia se evaluó en el valor de 0,05.

Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional de Investigación de Vida Silvestre del USDA bajo el protocolo de investigación aprobado QA-2597. NOTA: El siguiente protocolo describe el procedimiento de análisis para detectar el ácido metil-iofenoxic en suero de mangosta. Este método es la versión final de un proceso iterativo que comenzó con el análisis del ácido etil-iofenoxic en suero de mangosta. Durante la ev…

Representative Results

En la Figura 1se presentan cromatogramas iónicos representativos de un análisis me-IPA. El suero de mangosta de control (Figura1A)ilustra el tiempo de retención de et-IPA (analito suplente) y la ausencia de me-IPA en el tiempo de retención indicado. La muestra de control de calidad (Figura1B)ilustra la separación de línea de base de me-IPA de et-IPA, así como las transiciones de cuantificador …

Discussion

El método LC-MS/MS desarrollado para los estudios utilizó la selectividad de la monitorización de reacciones múltiples para cuantificar con precisión me-IPA y et-IPA en suero de mangosta. La selectividad de la detección de MS/MS también permitió un protocolo de limpieza simple que dependía únicamente de acetonitrilo para precipitar proteínas del suero antes del análisis.

Los ácidos iophenoxic son solubles en ACN pero son prácticamente insolubles en agua. Para excluir el agua de l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue apoyada en parte por el programa de investigación intramuros del Departamento de Agricultura, Servicio de Inspección de Sanidad Animal y Vegetal de los Estados Unidos, Servicios de Vida Silvestre, Programa Nacional de Gestión de la Rabia y IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Alemania).

Materials

Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

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Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

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