Analyse des analogues de l'acide iophénoxique chez la petite mangouste indienne (Herpestes Auropunctatus) Sera pour utilisation comme marqueur biologique de vaccination contre la rage buccale
Summary
Nous avons offert aux mangoustes captives des appâts vaccinales contre la rage buccale placebo avec de l’acide éthylique ou méthyle iophenoxique comme biomarqueur et vérifié l’utilisation d’appâts à l’aide d’une nouvelle chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).
Abstract
La petite mangouste indienne (Herpestes auropunctatus) est un réservoir de virus de la rage (RABV) à Porto Rico et comprend plus de 70% des cas de rage animale signalés chaque année. Le contrôle de la circulation du RABV dans les réservoirs fauniques est généralement réalisé par une stratégie de vaccination antirabique orale (VVA). À l’heure actuelle, il n’existe aucun programme ORV sur la faune à Porto Rico. Des recherches sur les vaccins antirabiques oraux et divers types d’appâts pour les mangoustes ont été menées avec des résultats prometteurs. La surveillance du succès de l’ORV repose sur l’estimation de l’étude des appâts par les espèces cibles, ce qui implique généralement l’évaluation d’un changement dans les anticorps neutralisants RABV (RVNA) après la vaccination. Cette stratégie peut être difficile à interpréter dans les zones ayant un programme actif de VRO pour la faune ou dans les zones où le RABV est enzootique et où les niveaux de fond de l’ARV sont présents chez les espèces réservoirs. Dans de telles situations, un biomarqueur incorporé avec le vaccin ou la matrice d’appâtpeut-nous peut être utile. Nous avons offert 16 appâts ORV placebo de mangouste captifs contenant de l’acide éthylo-iophenoxique (et-IPA) dans des concentrations de 0,4 % et 1 % à l’intérieur de l’appât et de 0,14 % dans la matrice externe de l’appât. Nous avons également offert 12 appâts ORV en captivité contenant de l’acide méthyl-iophénoxique (me-IPA) dans des concentrations de 0,035%, 0,07% et 0,14% dans la matrice d’appâts externes. Nous avons recueilli un échantillon de sérum avant l’offre d’appâts, puis hebdomadaire pour un jusqu’à huit semaines après l’offre. Nous avons extrait des acides iophenoxic de sérum dans l’acétonitrile et quantifiés utilisant la chromatographie liquide/spectrométrie de masse. Nous avons analysé le sérum pour et-IPA ou moi-IPA par spectrométrie liquide de chromatographie-masse. Nous avons trouvé la capacité de marquage adéquate pendant au moins huit et quatre semaines pour et- et- et moi-IPA, respectivement. Les deux dérivés de l’API pourraient convenir à l’évaluation sur le terrain de l’utilisation des appâts ORV chez les mangoustes. En raison de la longévité du marqueur dans le sérum de mangouste, il faut veiller à ne pas confondre les résultats en utilisant le même dérivé DE l’API lors d’évaluations consécutives.
Introduction
Le virus de la rage (RABV) est un lyssavirus échoué unique de sens négatif, et circule parmi diverses espèces de réservoir satifieux dans les ordres Carnivora et Chiroptera. Plusieurs espèces de mangouste sont des réservoirs de RABV, et la petite mangouste indienne (Herpestes auropunctatus) est le seul réservoir à Porto Rico et d’autres îles des Caraïbes dans l’hémisphère occidental1,2,3 . Le contrôle de la circulation du RABV dans les réservoirs fauniques est généralement réalisé grâce à une stratégie de vaccination antirabique orale (VVA). Aux États-Unis, cette activité de gestion est coordonnée par l’USDA/APHIS/Wildlife Services National Rabies Management Program (NRMP)4. À l’heure actuelle, il n’existe aucun programme ORV sur la faune à Porto Rico. Des recherches sur les vaccins antirabiques et divers types d’appâts pour les mangoustes ont été menées avec des résultats prometteurs suggérant qu’un programme de VVA pour les mangoustes est possible5,6,7,8.
La surveillance de l’impact de la VCO repose sur l’estimation de l’étude des appâts par les espèces cibles, ce qui implique généralement l’évaluation d’un changement dans la séroprévalence des anticorps RV. Cependant, cette stratégie peut être difficile dans les zones où les programmes de vRO de la faune sont actifs ou dans les zones où les niveaux de RV sont enzootiques et où les niveaux de fond des anticorps neutralisants RABV (RVNA) sont présents chez les espèces réservoirs. Dans de telles situations, un biomarqueur inclus dans l’appât ou la matrice externe d’appât peut être utile.
Divers marqueurs biologiques ont été utilisés pour surveiller l’utilisation des appâts chez de nombreuses espèces, y compris les ratons laveurs (Procyon lotor)9,10, stoats (Mustela ermine)11,12, blaireaux européens ( Meles Meles) 13, sangliers (Sus scrofa)14, petites mangoustes indiennes15 et chiens de prairie (Cynomysludovicianus)16,17, entre autres. Aux États-Unis, les appâts OPÉRATIONNELS de l’ORV comprennent souvent un biomarqueur de tétracycline de 1 % dans la matrice d’appâts pour surveiller l’accumulation d’appâts18,19. Cependant, les inconvénients de l’utilisation de la tétracycline comprennent une préoccupation croissante au sujet de la distribution d’antibiotiques dans l’environnement et que la détection de la tétracycline est généralement invasive, nécessitant l’extraction dentaire ou la destruction de l’animal pour obtenir des os échantillons20. Rhodamine B a été évalué comme marqueur dans une variété de tissus et peut être détecté à l’aide de la lumière ultraviolette (UV) et la fluorescence dans les cheveux et les moustaches10,21.
L’acide iophénoxique (API) est une poudre blanche et cristalline qui a été utilisée pour évaluer la consommation d’appâts chez les coyotes (Canis latrans)22, renard arctique (Vulpes lagopus)23, renard roux (Vulpes vulpes)24, ratons laveurs 9 (en) , 25, sanglier14, cerf rouge (Cervus elaphus scoticus)26, blaireaux européens12 et furets (M. furo)27, parmi plusieurs autres espèces de mammifères. Les temps de rétention de l’API varient selon les espèces de moins de deux semaines dans certains marsupiaux28,29, à au moins 26 semaines en ongulés26 et plus de 52 semaines chez les chiens domestiques (Canis lupus familiaris)30. Les temps de rétention peuvent également dépendre de la dose31. L’acide iophénoxique se lie fortement à l’albumine de sérum et a été historiquement détecté en mesurant des niveaux d’iode de sang32. Cette approche indirecte a été supplantée par des méthodes de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) pour mesurer directement les concentrations d’acide iophénoxique avec détection UV33, et éventuellement avec la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (LCMS) 34,35. Pour cette étude, une chromatographie liquide très sensible et sélective avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) méthode a été développée qui utilise la surveillance de réaction multiple (MRM) pour quantifier deux analogues de l’acide iophenoxique. Notre objectif était d’utiliser cette méthode LC-MS/MS pour évaluer la capacité de marquage de l’acide propanoïque 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl) (méthyl-IPA ou moi-IPA) et 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl)l’acide butanoïque (éthyl-IPA ou et-IPA) et lorsqu’il est livré dans un ORV appât pour les mangoustes en captivité.
Les mangoustes ont été capturées vivantes dans des pièges à cages appâtés avec des saucisses fumées et de l’huile de poisson disponibles dans le commerce. Les mangoustes étaient logées dans des cages individuelles de 60 cm x 60 cm x 40 cm en acier inoxydable et nourrissaient une ration quotidienne de 50 g d’aliments commerciaux secs pour chats, complétées deux fois par semaine par une cuisse de poulet disponible dans le commerce. L’eau était disponible ad libitum. Nous avons livré deux dérivés de l’IPA, l’éthyle-IPA et le méthyle-IPA, aux mangoustes captives dans les appâts ORV placebo. Tous les appâts étaient composés d’un blister de 28 mm x 20 mm x 9 mm avec un revêtement externe (ci-après « matrice d’appâts ») contenant de l’œuf de poulet en poudre et de la gélatine (Tableaudes matériaux). Les appâts contenaient 0,7 ml d’eau ou de dérivés de l’API et pesaient environ 3 g, dont 2 g étaient la matrice externe de l’appât.
Nous avons offert 16 mangoustes captives et-IPA en trois concentrations : 0,14 % (2,8 mg et-IPA dans une matrice d’appâts de 2 g; 3 mâles [m], 3 femelles [f]), 0,4 % (2,8 mg et IPA en volume blister de 0,7 mL; 3 ml, 3f) et 1,0 % (7,0 mg d’éthyl-IPA en volume de 0,7 mL; , 2f). La dose globale de 2,8 mg correspond à un taux de dose de 5 mg/kg27,36 et est basée sur un poids moyen de mangouste de 560 g à Porto Rico. Nous avons choisi 1% comme la concentration la plus élevée que la recherche suggère l’aversion du goût à certains biomarqueurs peuvent se produire à des concentrations de ‘gt;1% chez certaines espèces37. Nous avons seulement offert la dose de 1% dans le paquet de blister car la flocculation a empêché le soluté de se dissoudre dans le solvant suffisamment pour être uniformément incorporé dans la matrice d’appât. Un groupe témoin (2m, 1f) a reçu des appâts remplis d’eau stérile et pas d’IPA. Nous avons offert des appâts aux mangoustes le matin (8 heures du matin) pendant ou avant l’alimentation de leur ration d’entretien quotidien. Les restes d’appâts ont été enlevés après environ 24 heures. Nous avons prélevé des échantillons de sang avant le traitement, un jour après le traitement, puis chaque semaine jusqu’à 8 semaines après le traitement. Nous avons anesthésié les mangoustes par inhalation de gaz isoflurane et recueillijusqu’à 1,0 ml de sang entier par venipuncture du cava de véa crânienne comme décrit pour les furets38. Nous avons centrifugé des échantillons de sang entier, transféré le sérum aux cryovials et les avons stockés à -80 oC jusqu’à l’analyse. Tous les animaux n’ont pas été échantillonnés pendant toutes les périodes afin de minimiser les impacts des prélèvements répétés de sang sur la santé des animaux. Les animaux témoins ont été échantillonnés le jour 0, puis hebdomadaires pendant jusqu’à 8 semaines après le traitement.
Nous m’avons livré l’IPA en trois concentrations : 0,035 % (0,7 mg), 0,07 % (1,4 mg) et 0,14 % (2,8 mg), tous incorporés dans la matrice d’appâts, avec 2 mâles et 2 femelles par groupe de traitement. Deux mâles et deux femelles ont reçu des appâts remplis d’eau stérile et pas d’IPA. Les heures d’offrande d’appât et l’anesthésie de mangouste sont décrites ci-dessus. Nous avons prélevé des échantillons de sang avant le traitement le jour 1, puis chaque semaine jusqu’à 4 semaines après le traitement.
Nous avons testé des données de concentration de sérum pour la normalité et les moyens estimés pour des concentrations d’IPA de sérum de différents groupes de traitement. Nous avons utilisé un modèle mixte linéaire pour comparer les concentrations moyennes de sérum et d’IPA mises en commun entre les individus. Le type d’appât (matrice/blister pack) était un effet fixe en plus de la journée expérimentale, tandis que l’iD animal était un effet aléatoire. Toutes les procédures ont été exécutés à l’aide d’un logiciel statistique commun (tableaudes matériaux)et l’importance a été évaluée à 0,05 euro.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode LC-MS/MS développée pour les études a utilisé la sélectivité de la surveillance des réactions multiples pour quantifier avec précision l’IpA et l’IPA dans le sérum de mangouste. La sélectivité de la détection de la SP/MS a également permis un protocole de nettoyage simple qui repose uniquement sur l’acétonitrile pour précipiter les protéines du sérum avant l’analyse.
Les acides iophénoxiques sont solubles dans l’ACN mais sont pratiquement insolubles dans l’eau. Po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue en partie par le programme de recherche intra-muros du Us Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Rabies Management Program et IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Allemagne).
Materials
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
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