ניתוח של חומצה והידרוקסימית מקבילים בנמייה הודית קטנה (הרבלס) סרה לשימוש בתור חיסון בעל פה כלבת מרקר ביולוגי
Summary
הצענו בשבי מונגוז פלצבו בכלבת אוראלי חיסון פיתיונות עם החומצה אתיל או מתיל בצורת ביוארקר וספיגת פיתיון מאומת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית הרומן עם טנדם המסה (LC-ms/MS) שיטה.
Abstract
הנמייה ההודית הקטנה היא מאגר של וירוס כלבת (RABV) בפוארטו ריקו, וכוללת מעל 70% ממקרי כלבת בעלי חיים שדווחו מדי שנה. השליטה של מחזור RABV במאגרים של חיות הבר מושגת בדרך כלל על ידי אסטרטגיה של חיסון לכלבת אוראלי (ORV). כרגע אין תוכנית ORV חיות בר קיים בפורטו ריקו. מחקר על חיסונים לכלבת אוראלי וסוגי פיתיון שונים עבור מונגוז נערכו עם תוצאות מבטיחות. ניטור ההצלחה של ORV מסתמך על אומדן ספיגת הפיתיון על ידי מינים היעד, אשר בדרך כלל כרוך בהערכת שינוי ב-RABV נוגדנים נטרול (RVNA) לאחר החיסון. אסטרטגיה זו עלולה להיות קשה לפרש באזורים עם תוכנית החיות הפעיל ORV או באזורים שבהם RABV הוא ברמות הרקע enzootic ו-RVNA הם נמצאים מינים המאגר. במצבים כאלה, משולב בסמנים עם החיסון או מטריצה הפיתיון עשוי להיות שימושי. הצענו 16 בשבי מונגוסס פלצבו ORV המכיל את חומצה אתיל-מאוקסימית (et-IPA) בריכוזים של 0.4% ו 1% בתוך הפיתיון ו 0.14% במטריקס הפיתיון החיצוני. כמו כן, הצענו 12 מונגוז ORV בשבי מכיל חומצה מועלת (me-IPA) בריכוזים של 0.035%, 0.07% ו 0.14% ב מטריצה הפיתיון החיצוני. אספנו דגימת נסיוב לפני הצעת הפיתיון ושבוע לאחר מכן עד שמונה שבועות שלאחר ההנפקה. הצלחנו לחלץ את חומצות הנלואוקמית מסרה לתוך השימוש בספקטרומטר כרומטוגרפיה/ספקטרומטריה כרומטוגרפית נוזלית. בעזרת ספקטרומטר כרומטוגרפיה. נוזלי מאסיבי מצאנו יכולת סימון נאותה לפחות שמונה וארבעה שבועות עבור et-ו-IPA, בהתאמה. נגזרות IPA שני יכול להיות מתאים להערכת שטח של ספיגת פיתיון ORV ב mongooses. בשל תוחלת החיים של הסמן ב נמייה, הטיפול חייב להילקח כדי לא לבלבל את התוצאות באמצעות נגזרות IPA אותו במהלך הערכות רצופות.
Introduction
וירוס כלבת (RABV) הוא הגיון שלילי אחד שנתקע lyssavirus, ו מסתובב בין מינים שונים של מאגר חיות הבר בתוך הזמנות טורפים וכפות. מינים מרובים של נמייה הם מאגרים של RABV, והנמייה ההודית הקטנה (הרסוויס אורובוטאוס) היא המאגר היחיד בפוארטו ריקו ובאיים הקאריביים בחצי הכדור המערבי1,2,3 . השליטה על מחזור RABV במאגרים של חיות הבר מושגת בדרך כלל באמצעות אסטרטגיה של חיסון נגד כלבת (ORV). בארצות הברית (ארה ב), פעילות ניהול זו מתואמת על ידי התוכנית לניהול כלבת משרד החקלאות/שירותי הטבע (NRMP)4. כרגע אין תוכנית ORV חיות בר קיים בפורטו ריקו. מחקר לחיסונים כלבת וסוגי פיתיון שונים עבור מונגוז נערך עם תוצאות מבטיחות המציעה תוכנית orv עבור מונגוז אפשרי5,6,7,8.
ניטור ההשפעה של ORV מסתמך על אומדן ספיגת הפיתיון על ידי מינים היעד, אשר בדרך כלל כרוך בהערכת שינוי של נוגדן RV seroprevalence. עם זאת, אסטרטגיה זו עשויה להיות מאתגרת באזורים עם תוכניות בעלי חיים הפעיל ORV או באזורים שבהם RV הוא ברמות הרקע enzootic ו של בעלי החיים לנטרול נוגדנים (RVNA) נמצאים מינים מאגר. במצבים כאלה, ניתן לעשות שימוש בסמנים הנכללים בפיתיון או במטריצת הפיתיון החיצונית.
סמנים ביולוגיים שונים שימשו כדי לפקח על ספיגת הפיתיון במינים רבים, כוללדביבונים (procyon לואטור)9,10, stoats (מוסטאלהארמין)11,12, גיריות אירופאיות ( מלוז מלכים) 13, חזירי בר (סוס)14, מונגוז הודית קטנה15 וכלבי ערבה (קינויסלדוסינוס)16,17, בין היתר. בארה ב, מבצעי orv בבית לעתים קרובות כוללים 1% טטרציקלין ביוארקר במטריקס הפיתיון כדי לפקח על ספיגת הפיתיון18,19. עם זאת, החסרונות לשימוש טטרציקלין כוללים דאגה גוברת על התפלגות של אנטיביוטיקה לסביבה ואיתור של טטרציקלין הוא פולשני בדרך כלל, המחייב שאיבת שיניים או הרס של בעל החיים כדי להשיג עצם . דוגמיות של20 Rhodamine B כבר הוערך כסמן במגוון של רקמות ניתן להבחין באמצעות אולטרה סגול (UV) אור וזריחה בשיער ושפמונים10,21.
חומצה וולקסימית (IPA) היא אבקה לבנה וגבישית ששימשו להערכת צריכת הפיתיון בזאבי ערבות (כלב לאטטרנס)22, שועל ארקטי (וולפסי לגונה)23,שועל אדום (וולפסי)24, דביבונים מיכל בן 10 , 25, בר חזיר14, צבאים אדומים (סרבייוס אלאפיוס סקוקוס)26, גיריות אירופאיות12 וחמוסים (מ. furo)27, בין מינים אחרים של יונקים. זמני שמירה של IPA משתנה על ידי מינים מתוך פחות משבועיים בכמה חיות כיס28,29, לפחות 26 שבועות בפרסתנים26 ומעל 52 שבועות כלבים ביתיים (כלב זאב משפחה)30. זמני השמירה עשויים להיות גם תלויים במינון31. חומצה והאנקסימית נקשר בחוזקה לאלבומין הנסיוב והוא זוהה היסטורית על ידי מדידת רמות יוד בדם32. גישה עקיפה זו הייתה מתבצעת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים כדי למדוד במישרין את ריכוזי החומצה המיאוקסיליים עם זיהוי UV33, ובסופו של דבר עם כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטר מסה (lcms) . 34,35. עבור מחקר זה, כרומטוגרפיה מאוד רגיש וסלקטיבי של נוזל עם מספר ספקטרומטר מאסיבי (LC-MS/MS) שיטת פותחה העושה שליטה מרובה התגובה (MRM) כדי לכמת שני אנמים אנלוגיים של חומצה ולבן. המטרה שלנו היתה להשתמש בשיטה זו LC-MS/MS כדי להעריך את היכולת סימון של 2-(3-הידרוxy-2, 4, 6-טרייודובנזיל חומצה (מתיל-IPA או me-IPA) ו 2-(3-הידרוxy-2, 4, 6-טרייודובנזיל) חומצה בוטאית (אתיל-IPA או et-IPA) וכאשר נמסר ORV פיתיון. למונגוסים שבשבי
מונגוסס היו חיים שנתפסו במלכודות כלוב עם נקניקים מעושנים זמין מסחרית שמן דגים. Mongooses היו שוכנו בודדים 60 ס מ x 60 ס”מ x 40 ס מ כלובי פלדת אל-חלד האכיל הקצבה יומית של ~ 50 g מסחרי מזון חתול יבש, שיושלם פעמיים בשבוע עם ירך עוף זמין מסחרית. . המים היו זמינים לפרסום הבאנו שני נגזרים של IPA, אתיל-ipa ו-מתיל-ipa, בשבי מונגוז ב פלצבו orv baits. כל פיתיונות היו מורכבים 28 מ”מ x 20 מ”מ x 9 מ”מ חבילת שלפוחית לסכל עם ציפוי חיצוני (להלן” מטריצה הפיתיון “) המכיל אבקת עוף ביצה ו ג’לטין (טבלת חומרים). Baits הכיל 0.7 mL של נגזרות מים או IPA ושקל כ 3 גרם, אשר ~ 2 g היה מטריצה הפיתיון החיצוני.
הצענו 16 בשבי מונגוז-IPA בשלושה ריכוזים 0.14% (2.8 מ ג et-IPA ב ~ 2 g מטריצה פיתיון; 3 גברים [m], 3 נקבות [f]), 0.4% (2.8 mg et-IPA ב-0.7 mL חבילת נפח שלפוחית; 3m, 3m), ו-1.0% (7.0 mg אתיל-IPA בשנת 0.7 שלפוחית לארוז נפח; 2m , 2f). המינון הכולל של 2.8 mg מקביל לשיעור מינון של 5 מ”ג/ק”ג27,36 והוא מבוסס על משקל נמייה ממוצע של 560 g בפורטו ריקו. בחרנו 1% כריכוז הגבוה ביותר כמו מחקר מרמז על שנאת הטעם כמה בסמנים עשויים להתרחש בריכוזים > 1% מינים מסוימים37. הצענו את המנה היחידה בחבילת השלפוחית כחומר מונע את המסיסות מלהתמוסס בממס מספיק כדי להיות משולב באופן שווה לתוך מטריצת הפיתיון. קבוצת שליטה אחת (2m, 1f) קיבלה פיתיונות מלא מים סטרילי ללא IPA. הצענו פיתיונות למונגוסס בבוקר (~ 8 בבוקר) במהלך או לפני האכלה הקצבה היומית שלהם. שרידי הפיתיון הוסרו לאחר כ -24 שעות. אספנו דגימות דם לפני טיפול, יום אחד לאחר הטיפול ולאחר מכן שבועי עד 8 שבועות לאחר הטיפול. אנו מלדמים מונגוז על ידי שאיפת של גז isof, ונאסף עד 1.0 mL של דם שלם על ידי והניקוב של הווריד הגולגולתית כפי שתוארה עבור חמוסים38. אנחנו centrifuged דגימות דם שלמות, העבירו את סרה לקריובקבוקונים ואחסנו אותם ב-80 ° צ’ עד לניתוח. לא כל החיות נדגמו במהלך כל פרקי הזמן כדי למזער את ההשפעות של הדם החוזר על בריאותם של בעלי החיים. שליטה בעלי חיים שנדגמו ביום 0, ואז שבועי של עד 8 שבועות לאחר הטיפול.
שמנו אותי-IPA בשלושה ריכוזים: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) ו-0.14% (2.8 mg), כל שולבו בתוך מטריצה הפיתיון, עם 2 זכרים ו-2 נקבות לכל קבוצת הטיפול. שני זכרים ושתי נקבות קיבלו את המנה המלאה במים סטריליים ובלי IPA. שעות ההנפקה וההרדמה מתוארות לעיל. אספנו דגימות דם לפני טיפול ביום 1, ולאחר מכן שבוע עד 4 שבועות לאחר הטיפול.
בדקנו את הסרום מידע עבור נורמליות ואמצעים מוערכים עבור ריכוזי הסרום IPA של קבוצות טיפול שונות. השתמשנו במודל מעורב ליניארי כדי להשוות ריכוזי הסרום et-IPA במאגר על פני אנשים. סוג פיתיון (מטריקס/שלפוחית pack) היה השפעה קבועה בנוסף ליום ניסיוני, בעוד מזהה בעלי חיים היה השפעה אקראית. כל ההליכים הנוהלים באמצעות תוכנה סטטיסטיתמשותפת (טבלת חומרים) ומשמעות הוערך ב α = 0.05.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה LC-MS/MS שפותחה עבור המחקרים ניצל את הסלקטיביות של ניטור תגובה מרובה כדי לכמת את me-IPA ו-et-IPA בסרום נמייה. הסלקטיביות של זיהוי MS/MS מותר גם עבור פרוטוקול ניקוי פשוט להסתמך רק על acetonitrile כדי לזרז חלבונים מסרום לפני ניתוח.
החומצות הפוקסיאיות מסיסים ב-ACN אך הן כמעט לא מסיסות במים. כ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר הפנים של מחלקת החקלאות של ארה ב, בעלי חיים ובריאות הצמח שירות, שירותי חיות הבר, התוכנית לניהול כלבת לאומי IDT ביולוגיקה (Dessau-Rosslau, גרמניה).
Materials
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
References
- Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
- Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
- Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
- Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
- Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
- Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
- Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
- Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
- Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
- Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
- Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
- de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
- Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
- Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
- Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
- Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
- Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
- Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
- Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
- Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
- Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
- Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J., Shumake, S. A., Bullard, R. W. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. , 141-147 (1987).
- Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
- Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
- Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
- Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
- Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
- Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
- Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
- Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
- Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
- Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
- Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
- Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
- Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
- Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
- Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
- Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
- Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
- Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. . Mongooses: their natural history. , (1967).
- Stevens, C. E., Hume, I. D. . Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , (1995).
- National Rabies Management Program (NRMP). . Oral rabies vaccination draft operations manual. , (2009).
