Analisi degli analoghi dell'acido iofenostico nella piccola mangusta indiana (Herpestes Auropunctatus) Sera per l'uso come marcatore biologico di vaccinazione della rabbia orale
Summary
Abbiamo offerto esche da vaccino per la rabbia placebo delle manguste in cetticone con acido iofenico etilico o metilico come biomarcatore e l’assorbimento verificato delle esche utilizzando una nuova cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem (metodo LC-MS/MS).
Abstract
La piccola mangusta indiana(Herpestes auropunctatus) è un serbatoio di virus della rabbia (RABV) a Porto Rico e comprende oltre il 70% dei casi di rabbia animale segnalati annualmente. Il controllo della circolazione RABV nei serbatoi di fauna selvatica è in genere realizzato da una strategia di vaccinazione orale alla rabbia (ORV). Attualmente non esiste alcun programma ORV di fauna selvatica a Porto Rico. È stata condotta una ricerca sui vaccini per la rabbia orale e vari tipi di esche per le manguste con risultati promettenti. Il monitoraggio del successo dell’ORV si basa sulla stima dell’assorbimento delle esche da parte delle specie bersaglio, che in genere comporta la valutazione di un cambiamento negli anticorpi di neutralizzazione RABV (RVNA) dopo la vaccinazione. Questa strategia può essere difficile da interpretare in aree con un programma attivo ORV di fauna selvatica o in aree in cui RABV è enzootico e i livelli di fondo di RVNA sono presenti nelle specie di bacino. In tali situazioni, un biomarcatore incorporato con il vaccino o la matrice di esche può essere utile. Abbiamo offerto 16 manguste in cattività esche placebo ORV contenenti acido etilico-iofenico (et-IPA) in concentrazioni dello 0,4% e 1% all’interno dell’esca e dello 0,14% nella matrice esterna dell’esca. Abbiamo anche offerto 12 manguste in cattività esche ORV contenenti acido metilico-fenossia (me-IPA) in concentrazioni di 0,035%, 0,07% e 0,14% nella matrice di esca esterna. Abbiamo raccolto un campione di siero prima dell’offerta di esche e poi settimanalmente per un massimo di otto settimane dopo l’offerta. Abbiamo estratto gli acidi iofenossia dalla sera in acetonitrile e quantificato usando cromatografia liquida/spettrometria di massa. Abbiamo analizzato sera per et-IPA o me-IPA da spettrometria di cromatografia-massa liquida. Abbiamo trovato un’adeguata capacità di marcatura per almeno otto e quattro settimane rispettivamente per et- e me-IPA. Entrambi i derivati IPA potrebbero essere adatti per la valutazione sul campo dell’assorbimento delle esche ORV nelle manguste. A causa della longevità del marcatore in mangusta sera, bisogna fare attenzione a non confondere i risultati utilizzando lo stesso derivato IPA durante le valutazioni consecutive.
Introduction
Il virus della rabbia (RABV) è un lyssavirus singolo spiaggiato e circola tra diverse specie di bacini naturali all’interno degli ordini Carnivora e Chiroptera. Molteplici specie di manguste sono serbatoi di RABV, e la piccola mangusta indiana (Herpestes auropunctatus) è l’unico serbatoio in Porto Rico e altre isole caraibiche nell’emisfero occidentale1,2,3 . Il controllo della circolazione RABV nei serbatoi di fauna selvatica è in genere realizzato attraverso una strategia di vaccinazione orale della rabbia (ORV). Negli Stati Uniti (STATI Uniti), questa attività di gestione è coordinata dal USDA/APHIS/Wildlife Services National Rabies Management Program (NRMP)4. Attualmente non esiste alcun programma ORV di fauna selvatica a Porto Rico. La ricerca sui vaccini sulla rabbia e vari tipi di esche per le manguste è stata condotta con risultati promettenti suggerendo un programma ORV per le manguste è possibile5,6,7,8.
Il monitoraggio dell’impatto dell’ORV si basa sulla stima dell’assorbimento delle esche da parte delle specie bersaglio, che in genere comporta la valutazione di un cambiamento nella sieroprevalenza dell’anticorpo RV. Tuttavia, questa strategia può essere difficile nelle aree con programmi ORV di fauna selvatica attivi o in aree in cui la rV è enzootica e i livelli di fondo degli anticorpi di neutralizzazione RABV (RVNA) sono presenti nelle specie di bacino. In tali situazioni, un biomarcatore incluso nell’esca o nella matrice esterna dell’esca può essere utile.
Vari marcatori biologici sono stati utilizzati per monitorare l’assorbimento di esche in numerose specie, tra cui procioni ( lottoProcyon)9,10,stoats (Mustela ermina)11,12, tassi europei ( Meles meles) 13, cinghiali (Sus scrofa)14, piccole manguste indiane15 e cani della prateria (Cynomysludovicianus)16,17, tra gli altri. Negli Stati Uniti, le esche ORV operative spesso includono un biomarcatore tetraciclino dell’1% nella matrice delle esche per monitorare l’assorbimento delle esche18,19. Tuttavia, gli inconvenienti all’uso della tetraciclina includono una crescente preoccupazione per la distribuzione di antibiotici nell’ambiente e che l’individuazione della tetraciclina è tipicamente invasiva, richiedendo l’estrazione dei denti o la distruzione dell’animale per ottenere l’osso campioni20. La rhodamina B è stata valutata come marcatore in una varietà di tessuti e può essere rilevata utilizzando la luce ultravioletta (UV) e la fluorescenza nei capelli e nei baffi10,21.
L’acido iofenosssia (IPA) è una polvere cristallina bianca che è stata utilizzata per valutare il consumo di esche nei coyote (Canis latrans)22, volpe artica (Vulpes lagopus)23, volpe rossa (Vulpes vulpes)24, procioni 9 (in vie , 25, cinghiale14, cervo rosso (Cervus elaphus scoticus)26, tassi europei12 e furetti (M. furo)27, tra diverse altre specie di mammiferi. I tempi di ritenzione dell’IPA variano a seconda delle specie da meno di due settimane in alcuni marsupiali28,29, ad almeno 26 settimane in ungulates26 e oltre 52 settimane in cani domestici (Canis lupus familiaris)30. Tempi di ritenzione possono anche essere dose-dipendente31. L’acido iofenostico si lega fortemente all’albumina del siero ed è stato storicamente rilevato misurando i livelli di iodio nel sangue32. Questo approccio indiretto è stato soppiantato da metodi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per misurare direttamente le concentrazioni di acido iofenossia con rilevamento UV33, e alla fine con cromatografia liquida e spettrometria di massa (LCMS) 34,35. Per questo studio, è stata sviluppata una cromatografia liquida altamente sensibile e selettiva con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) che utilizza il monitoraggio della reazione multipla (MRM) per quantificare due analoghi di acido iofenosco. Il nostro obiettivo era quello di utilizzare questo metodo LC-MS/MS per valutare la capacità di marcatura di 2-(3-idrossi-2,4,6-triiodobenzyl)acido propanoico (metil-IPA o me (3-idrossi-2,4,6-triiodobenzyl)acido butanoico (ethyl-IPA o et-IPA) e quando consegnato in un ORV esca alle manguste in cattività.
Le manguste sono state catturate dal vivo in trappole a gabbia esche con salsicce affumicate e olio di pesce disponibili in commercio. Le manguste erano alloggiate in gabbie in acciaio inossidabile da 60 cm x 60 cm x 40 cm e alimentate con una razione giornaliera di cibo per gatti secchi commerciali da 50 g, completate due volte a settimana con una coscia di pollo disponibile in commercio. L’acqua era disponibile ad libitum. Abbiamo consegnato due derivati di IPA, ethyl-IPA e metil-IPA, alle manguste in cattività nelle esche ORV placebo. Tutte le esche erano composte da una confezione di blister di 28 mm x 20 mm x 9 mm con un rivestimento esterno (qui dopo “matrice di esca”) contenente uova di gallina in polvere e gelatina (Tabella deimateriali). Le esche contenevano 0,7 mL di acqua o derivato IPA e pesavano circa 3 g, di cui 2 g era la matrice di esche esterne.
Abbiamo offerto 16 manguste in cattività et-IPA in tre concentrazioni: 0.14% (2.8 mg et-IPA in matrice di esche da 2 g; 3 maschi [m], 3 femmine [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA in 0,7 ml di volume blister; 3m, 3f) e 1,0% (7,0 mg ethyl-IPA in 0,7 ml volume blister; 2m , 2f). La dose complessiva di 2,8 mg corrisponde a un tasso di dose di 5 mg/kg27,36 e si basa su un peso medio mangusta di 560 g a Porto Rico. Abbiamo selezionato l’1% come la concentrazione più alta come la ricerca suggerisce avversione al gusto per alcuni biomarcatori può verificarsi a concentrazioni >1% in alcune specie37. Abbiamo offerto solo la dose dell’1% nella confezione del blister come flocculazione ha impedito al soluto di sciogliersi nel solvente sufficientemente da essere incorporato uniformemente nella matrice dell’esca. Un gruppo di controllo (2m, 1f) ha ricevuto esche piene di acqua sterile e senza IPA. Abbiamo offerto esche alle manguste al mattino (8 a.m.) durante o prima dell’alimentazione della loro razione di mantenimento giornaliero. I resti di esca sono stati rimossi dopo circa 24 ore. Abbiamo raccolto campioni di sangue prima del trattamento, un giorno dopo il trattamento e poi settimanalmente fino a 8 settimane dopo il trattamento. Abbiamo anetizzato manguste per inalazione di gas isoflurano e raccolto fino a 1,0 mL di sangue intero da venipuncture della vena cava cranica come descritto per i furetti38. Abbiamo centrifugato campioni interi di sangue, trasferito sera ai crioviali e li abbiamo conservati a -80 gradi fino all’analisi. Non tutti gli animali sono stati campionati durante tutti i periodi di tempo per ridurre al minimo l’impatto del sangue ripetuto attinge alla salute degli animali. Gli animali di controllo sono stati campionati il giorno 0, poi settimanalmente per un massimo di 8 settimane dopo il trattamento.
Abbiamo consegnato me-IPA in tre concentrazioni: 0.035% (0.7 mg), 0.07% (1.4 mg) e 0.14% (2.8 mg), tutti incorporati nella matrice esca, con 2 maschi e 2 femmine per gruppo di trattamento. Due maschi e due femmine hanno ricevuto esche piene di acqua sterile e senza IPA. Esca che offre tempi e anestesia mangusta sono descritti sopra. Abbiamo raccolto campioni di sangue prima del trattamento il giorno 1, e poi settimanalmente fino a 4 settimane dopo il trattamento.
Abbiamo testato i dati sulla concentrazione del siero per verificare la normalità e i mezzi stimati per le concentrazioni di IPA del siero di diversi gruppi di trattamento. Abbiamo usato un modello misto lineare per confrontare le concentrazioni medie di siero et-IPA raggruppate tra gli individui. Il tipo di esca (matrice/blister pack) era un effetto fisso oltre al giorno sperimentale, mentre l’ID animale era un effetto casuale. Tutte le procedure sono state eseguite utilizzando un software statistico comune (Tabella dei materiali) e la significatività è stata valutata a 0,05 USD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo LC-MS/MS sviluppato per gli studi ha utilizzato la selettività del monitoraggio della reazione multipla per quantificare con precisione me-IPA ed et-IPA nel siero di mangusta. La selettività del rilevamento MS/MS ha anche permesso un semplice protocollo di pulizia basato esclusivamente sull’acetonitrile per far precipitare le proteine dal siero prima dell’analisi.
Gli acidi ifenossia sono solubili in ACN ma sono praticamente insolubili in acqua. Per escludere l’acqua dall’estrazion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal programma di ricerca intramurale del Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti, servizio di ispezione della salute animale e vegetale, servizi naturali, programma nazionale di gestione della rabbia e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Germania).
Materials
| Acetonitrile, Optima grade | Fisher | A996 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size | Waters Corp. | 186003085 | |
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ethyl-iophenoxic acid, 97 % | Sigma Aldrich | N/A | Lot MKBP5399V |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher | A117 | |
| LCMS software | Agilent | MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis | |
| Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR0709514717 |
| Microanalytical balance | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415C | |
| MS/MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Oral Rabies Vaccine Baits | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany | N/A | |
| Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lot PR100612108RR |
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined | Agilent | 5190-7024 | |
| Sodium chloride, Certified ACS grade | Fisher | S271 | |
| Statistical Software Package | SAS Institute, Cary, North Carolina, USA | N/A | |
| Trifluoroacetic acid, 99 % | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Vortex Mixer | Glas-Col | 099A PV6 | |
| 0.2-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.413 | |
| 0.5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.421 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-µL capacity pipette tips | GeneMate | P-1233-1250 | |
| 1-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.43 | |
| 2-mL amber screw-top autosampler vials | Agilent | 5182-0716 | |
| 5-mL pipettor tips | Eppendorf | 30089.456 | |
| 80-position microcentrifuge tube rack | Fisher | 05-541-2 | |
| 8-mL amber vials with PTFE-lined caps | Wheaton | 224754 | |
| 70 % (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µL air displacement pipette | Eppendorf | ES-100 |
References
- Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
- Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, West Indies, and implications for control. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (10), e3251 (2004).
- Monroe, B. P., et al. Rabies surveillance in the United States during 2014. Journal of the American Veterinary Medical Association. 248 (7), 777-788 (2015).
- Slate, D., et al. Status of oral rabies vaccination in wild carnivores in the United States. Virus Research. 111, 68-76 (2005).
- Blanton, J. D., et al. Vaccination of small Asian mongoose (Herpestes javanicus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 42 (3), 663-666 (2006).
- Vos, A., et al. Oral vaccination of captive small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) against rabies. Journal of Wildlife Diseases. 49 (4), 1033-1036 (2013).
- Berentsen, A. R., Johnson, S. R., VerCauteren, K. C. Evaluation of ONRAB® bait matrix flavor preference by mongoose (Herpestes auropunctatus) in Puerto Rico: Implications for Oral Rabies Vaccination. Caribbean Journal of Science. 48 (1), 52-58 (2014).
- Ortmann, S., et al. Safety studies with the oral rabies virus vaccine strain SPBN GASGAS in the small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus). BMC Veterinary Research. 14 (1), 90 (2018).
- Linhart, S. B., et al. A field evaluation of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons (Procyon lotor). Journal of Wildlife Diseases. 30 (2), 185-194 (1994).
- Fry, T. L., Atwood, T., Dunbar, M. R. Evaluation of rhodamine B as a biomarker for raccoons. Human Wildlife Interactions. 4 (2), 275-280 (2010).
- Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations. New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).
- de Leeuw, A. N. S., Smith, G. C., Woods, J. A. Use of iophenoxic acid to assess bait uptake by European badgers. Advances in Vertebrate Pest Management. 4, 243-254 (2006).
- Southey, A. K., Sleeman, D. P., Gormley, E. Sulfadimethoxine and rhodamine B as oral biomarkers for European badgers (Meles meles). Journal of Wildlife Diseases. 38 (2), 378-384 (2002).
- Massei, G., Jones, A., Platt, T., Cowan, D. P. Iophenoxic Acid as a Long-Term Marker for Wild Boar. Journal of Wildlife Management. 73 (3), 458-461 (2009).
- Creekmore, T. E., et al. Field evaluation of baits and baiting strategies for delivering oral vaccine to mongooses in Antigua, West Indies. Journal of Wildlife Diseases. 30 (4), 497-505 (1994).
- Creekmore, T. E., Rock, R. E., Hurley, J. A baiting system for delivery of an oral plague vaccine to black-tailed prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 38 (1), 32-39 (2002).
- Fernandez, J. R. R., Rocke, R. E. Use of Rhodamine B as a biomarker for oral plague vaccination of prairie dogs. Journal of Wildlife Diseases. 47 (3), 765-768 (2011).
- Johnston, J. J., et al. Evaluation and significance of tetracycline stability in rabies vaccine baits. Journal of Wildlife Diseases. 41 (3), 549-558 (2005).
- Algeo, T. P., et al. Oral rabies vaccination variation in tetracycline biomarking among Ohio Raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 49 (2), 332-337 (2013).
- Crier, J. K. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 34 (4), 829-834 (1970).
- Fisher, P. Review of using Rhodamine B as a marker for wildlife studies. Wildlife Society Bulletin. 27 (2), 318-329 (1999).
- Knowlton, F. K., Savarie, P. J., Wahlgren, C. E., Hayes, D. J., Shumake, S. A., Bullard, R. W. Physiological marks by coyotes ingesting baits containing iophenoxic acid, Mirex and Rhodamine B. Vertebrate Pest Control and Management Materials. , 141-147 (1987).
- Follmann, E. H., Savarie, P. J., Ritter, D. G., Baer, G. M. Plasma marking of arctic foxes with iophenoxic acid. Journal of Wildlife Diseases. 23 (4), 709-712 (1987).
- Saunders, G., Harris, S., Eason, C. T. Iophenoxic acid as a quantitative bait marker for foxes. Wildlife Research. 20, 297-302 (1993).
- Hadidian, J., et al. Acceptance of simulated oral rabies vaccine baits by urban raccoons. Journal of Wildlife Diseases. 25 (1), 1-9 (1989).
- Sweetapple, P. J., Nugent, G. Iophenoxic acid as a serum marker for red deer (Cervus elaphus scoticus). Wildlife Research. 25, 649-654 (1998).
- Ogilvie, S. C., Eason, C. T. Evaluation of iophenoxic acid and rhodamine B for marking feral ferrets (Mustela furo). New Zealand Journal of Zoology. 25 (2), 105-108 (1998).
- Eason, C. T., Batcheler, D., Frampton, C. M. Comparative pharmacokinetics of iophenoxic acid in cats and brushtail possums. Wildlife Research. 21, 377-380 (1994).
- Fisher, P. M., Marks, C. A. Evaluation of iophenoxic acid as a biomarker for swamp wallabies (Wallabia bicolor). Wildlife Research. 24, 97-103 (1997).
- Baer, G. M., Shaddock, J. H., Hayes, D. J., Savarie, P. Iophenoxic acid as a serum marker in carnivores. Journal of Wildlife Management. 49 (1), 49-51 (1985).
- Spurr, E. B. Iophenoxic acid as a systemic blood marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela ermine) and weasels (Mustela nivalis). New Zealand Journal of Zoology. 29 (2), 135-142 (2002).
- Mudge, G. H., Strewler, G. J., Desbiens, N., Berndt, W. O., Wade, D. N. Excretion and distribution of iophenoxic acid. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 178 (1), 159-172 (1971).
- Jones, A. High-performance liquid chromatographic determination of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 654 (2), 293-296 (1994).
- Wiles, M. C., Campbell, T. A. Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for direct identification and quantification of iophenoxic acid in serum. Journal of Chromatography B. 832 (1), 144-157 (2006).
- Ballesteros, C., et al. Analysis by LC/ESI-MS of iophenoxic acid derivatives and evaluation as markers of oral baits to deliver pharmaceuticals to wildlife. Journal of Chromatography B. 878 (22), 1997-2002 (2010).
- Purdey, D. C., Petcu, M., King, C. M. A simplified protocol for detecting two systemic bait markers (Rhodamine B and iophenoxic acid) in small mammals. New Zealand Journal of Zoology. 30 (3), 175-184 (2003).
- Tobin, M. E., Koehler, A. E., Sugihara, R. Tetracyclines as a fluorescent marker in bones and teeth of rodents. Journal of Wildlife Management. 60 (1), 202-207 (1996).
- Briscoe, J. A., Syring, R. Techniques for emergency airway and vascular access in special species. Seminars in Avian and Exotic Pet Medicine. 13 (3), 118-131 (2004).
- Eason, C. T., Frampton, C. M. The plasma pharmacokinetics of iophenoxic and iopanoic acids in goat. Xenobiotica. 2 (2), 185-189 (1992).
- Hilton, H. E., Dunn, A. M. S. . Mongooses: their natural history. , (1967).
- Stevens, C. E., Hume, I. D. . Comparative physiology of the vertebrate digestive system. Second edition. , (1995).
- National Rabies Management Program (NRMP). . Oral rabies vaccination draft operations manual. , (2009).
