Summary

Analyse von Iophenoxic Acid Analoga in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera zur Verwendung als orale Tollwut-Impfung Biologischer Marker

Published: May 31, 2019
doi:

Summary

Wir boten in Gefangenschaft Mongooses Placebo orale Tollwut-ImpfstoffKöder mit Ethyl- oder Methyl-Iophenoxsäure als Biomarker und verifizierte Köderaufnahme mit einer neuartigen Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Methode an.

Abstract

Die kleine indische Gänse (Herpestes auropunctatus) ist ein Reservoir des Tollwutvirus (RABV) in Puerto Rico und umfasst über 70% der jährlich gemeldeten Tollwutfälle. Die Kontrolle des RABV-Kreislaufs in Wildtierreservoirs erfolgt in der Regel durch eine Strategie der oralen Tollwutimpfung (ORV). Derzeit gibt es kein OrV-Programm für Wildtiere in Puerto Rico. Die Forschung an oralen Tollwut-Impfstoffen und verschiedenen Ködertypen für Gänse wurde mit vielversprechenden Ergebnissen durchgeführt. Die Überwachung des Erfolgs von ORV beruht auf der Schätzung der Köderaufnahme durch Zielarten, was in der Regel die Bewertung einer Änderung der RABV-Neutralisierungsantikörper (RVNA) nach der Impfung beinhaltet. Diese Strategie kann in Gebieten mit einem aktiven ORV-Programm für Wildtiere oder in Gebieten, in denen RABV enzootisch ist und die Hintergrundniveaus von RVNA bei Reservoirarten vorhanden sind, schwierig sein. In solchen Situationen kann ein Biomarker, der mit dem Impfstoff oder der Ködermatrix aufgenommen wurde, nützlich sein. Wir boten 16 gefangene Mongos Placebo ORV Köder mit Ethyl-Iophenoxsäure (et-IPA) in Konzentrationen von 0,4% und 1% innerhalb des Köders und 0,14% in der externen Ködermatrix an. Wir boten auch 12 in Gefangenschaft gehaltene Mongos ORV Köder an, die Methyl-Iophenoxsäure (me-IPA) in Konzentrationen von 0,035%, 0,07% und 0,14% in der externen Ködermatrix enthalten. Wir sammelten eine Serumprobe vor dem Köder-Angebot und dann wöchentlich für bis zu acht Wochen Post-Angebot. Wir extrahierten Iophenoxic Säuren aus Seren in Acetonitril und quantifizierten mit flüssiger Chromatographie/Massenspektrometrie. Wir analysierten sera für et-IPA oder me-IPA mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie. Wir fanden eine ausreichende Markierungsfähigkeit für mindestens acht bzw. vier Wochen für et- bzw. me-IPA. Beide IPA-Derivate könnten für die Feldbewertung der ORV-Köderaufnahme in Mongos geeignet sein. Aufgrund der Langlebigkeit des Markers in mongoose sera ist darauf zu achten, dass die Ergebnisse nicht durch die Verwendung desselben IPA-Derivats während aufeinander folgender Auswertungen verwirrt werden.

Introduction

Das Tollwutvirus (RABV) ist ein einsträngiges Lyssavirus mit negativem Sinn und zirkuliert zwischen verschiedenen Tierreservoirarten innerhalb der Ordnungen Carnivora und Chiroptera. Mehrere Arten von Mongoose sind Reservoirs von RABV, und die kleine indische Mongoose (Herpestes auropunctatus) ist das einzige Reservoir in Puerto Rico und anderen karibischen Inseln in der westlichen Hemisphäre1,2,3 . Die Kontrolle der RABV-Zirkulation in Wildtierreservoirs erfolgt in der Regel durch eine Strategie der oralen Tollwutimpfung (ORV). In den Vereinigten Staaten (USA) wird diese Management-Aktivität vom USDA/APHIS/Wildlife Services National Tollwut Management Program (NRMP)4koordiniert. Derzeit gibt es kein OrV-Programm für Wildtiere in Puerto Rico. Die Forschung an Tollwut-Impfstoffen und verschiedenen Ködertypen für Gänse wurde mit vielversprechenden Ergebnissen durchgeführt, die darauf hindeuten, dass ein ORV-Programm für Gänse möglich ist5,6,7,8.

Die Überwachung der Auswirkungen von ORV beruht auf der Schätzung der Köderaufnahme durch Zielarten, was in der Regel die Bewertung einer Veränderung der RV-Antikörperseroprävalenz beinhaltet. Diese Strategie kann jedoch in Gebieten mit aktiven ORV-Programmen für Wildtiere oder in Gebieten, in denen RV enzootisch ist und die Hintergrundniveaus von RABV-neutralisierenden Antikörpern (RVNA) in Reservoir-Arten vorhanden sind, eine Herausforderung darstellen. In solchen Situationen kann ein Biomarker, der im Köder oder in der externen Ködermatrix enthalten ist, nützlich sein.

Verschiedene biologische Marker wurden verwendet, um die Aufnahme von Ködern bei zahlreichen Arten zu überwachen, einschließlich Waschbären (Procyon Lotor)9,10, Stoats (Mustela ermine)11,12, Europäische Dachse ( Meles meles) 13, Wildschweine (Sus scrofa)14, kleine indische Gänse15 und Präriehunde (Cynomysludovicianus)16,17, u.a. In den USA enthalten operative ORV-Köder oft einen 1% Tetracyclin-Biomarker in der Ködermatrix, um die Köderaufnahme18,19zu überwachen. Zu den Nachteilen bei der Verwendung von Tetracyclin gehört jedoch die wachsende Sorge über die Verteilung von Antibiotika in die Umwelt und dass der Nachweis von Tetracyclin typischerweise invasiv ist, was eine Zahnextraktion oder -zerstörung des Tieres erfordert, um Knochen zu erhalten. Proben20. Rhodamine B wurde als Marker in einer Vielzahl von Geweben bewertet und kann mit ultraviolettem (UV) Licht und Fluoreszenz in Haaren und Schnurrhaaren10,21nachgewiesen werden.

Iophenoxsäure (IPA) ist ein weißes, kristallines Pulver, das verwendet wurde, um köderlichen Verbrauch in Kojoten zu bewerten (Canis latrans)22, polarer Fuchs (Vulpes lagopus)23, Rotfuchs (Vulpes vulpes)24, Waschbären 9 , 25, Wildschwein14, Rotwild (Cervus elaphus scoticus)26, Europäische Dachse12 und Frettchen (M. furo)27, unter mehreren anderen Säugetierarten. Retentionszeiten von IPA variiert nach Arten von weniger als zwei Wochen in einigen Beuteltieren28,29, bis mindestens 26 Wochen in Huftieren26 und über 52 Wochen bei Haushunden (Canis lupus familiaris)30. Retentionszeiten können auch dosisabhängigsein 31. Iophenoxsäure bindet stark an Serumalbumin und wurde historisch durch Messung des Jodspiegels im Blut32nachgewiesen. Dieser indirekte Ansatz wurde durch Hochleistungsmethoden zur Flüssigchromatographie (HPLC) zur direkten Messung der Iophenoxsäurekonzentrationen mit UV-Detektion33und schließlich mit Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie (LCMS) ersetzt. 34,35. Für diese Studie wurde eine hochempfindliche und selektive Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Methode entwickelt, die multiple Reaction Monitoring (MRM) nutzt, um zwei Analoga von Iophenoxsäure zu quantifizieren. Unser Ziel war es, mit dieser LC-MS/MS-Methode die Markierungsfähigkeit von 2-(3-Hydroxy-2,4,6-Triiodobenzyl)Propansäure (Methyl-IPA oder me-IPA) und 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl)butansäure (ethyl-IPA oder et-IPA) und Köder an gefangene Gänse.

Die Gänse wurden in Käfigfallen, die mit handelsüblichen Räucherwürsten und Fischöl geködert wurden, live gefangen. Die Gänse wurden in einzelnen 60 cm x 60 cm x 40 cm Edelstahlkäfigen untergebracht und mit einer täglichen Ration von 50 g gewerblichem Trockenkatzenfutter von 50 g gefüttert, zweimal pro Woche mit einem handelsüblichen Hühnerschenkel ergänzt. Wasser war verfügbar ad libitum. Wir lieferten zwei Derivate von IPA, Ethyl-IPA und Methyl-IPA, an gefangene Mongos in Placebo-ORV-Ködern. Alle Köder setzten sich aus einer 28 mm x 20 mm x 9 mm Folienblisterpackung mit einer externen Beschichtung(nachfolgend “Ködermatrix”) mit pulverisiertem Hühnerei und Gelatine (Materialtabelle) zusammen. Köder enthielten 0,7 ml Wasser oder IPA-Derivat und wogen etwa 3 g, von denen 2 g die externe Ködermatrix war.

Wir boten 16 in Gefangenschaft gehaltene Mongooses et-IPA in drei Konzentrationen an: 0,14% (2,8 mg et-IPA in 2 g Ködermatrix; 3 Männchen [m], 3 Weibchen [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA in 0,7 ml Blisterpackungvolumen; 3m, 3f) und 1,0% (7,0 mg Ethyl-IPA in 0,7 ml Blisterpackung; 2 , 2f). Die Gesamtdosis von 2,8 mg entspricht einer Dosis von 5 mg/kg27,36 und basiert auf einem durchschnittlichen Gänsegewicht von 560 g in Puerto Rico. Wir wählten 1% als höchste Konzentration, da die Forschung darauf hindeutet, dass Geschmacksaversion zu einigen Biomarkern in Konzentrationen von >1% bei einigen Arten auftreten kann37. Wir boten nur die 1%-Dosis in der Blisterpackung an, da die Flockung verhinderte, dass sich die Lösung im Lösungsmittel ausreichend auflöste, um gleichmäßig in die Ködermatrix eingearbeitet zu werden. Eine Kontrollgruppe (2m, 1f) erhielt Köder, die mit sterilem Wasser und ohne IPA gefüllt waren. Wir boten Den Gänsen morgens (ca. 8 Uhr) während oder vor der Fütterung ihrer täglichen Pflegeration Köder an. Köderreste wurden nach etwa 24 Stunden entfernt. Wir sammelten Blutproben vor der Behandlung, einen Tag nach der Behandlung und dann wöchentlich bis zu 8 Wochen nach der Behandlung. Wir anästhetisierten Mongooses durch Einatmen von Isoflurangas und sammelten bis zu 1,0 ml Vollblut durch Venipunktion der Schädelvenenhöhle, wie für Frettchen beschrieben38. Wir zentrifugierten Vollblutproben, übertrugen Seren auf Kryovials und lagerten sie bis zur Analyse bei -80 °C. Nicht alle Tiere wurden in allen Zeiträumen beprobt, um die Auswirkungen wiederholter Blutentnahmen auf die Gesundheit der Tiere zu minimieren. Kontrolltiere wurden am Tag 0, dann wöchentlich für bis zu 8 Wochen nach der Behandlung beprobt.

Wir lieferten me-IPA in drei Konzentrationen: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) und 0,14% (2,8 mg), alle in die Ködermatrix integriert, mit 2 Männern und 2 Frauen pro Behandlungsgruppe. Zwei Männchen und zwei Weibchen erhielten Köder, die mit sterilem Wasser und ohne IPA gefüllt waren. Köder, die Zeiten und Mongooseanästhesie anbieten, werden oben beschrieben. Wir sammelten Blutproben vor der Behandlung am ersten Tag, und dann wöchentlich bis zu 4 Wochen nach der Behandlung.

Wir haben Serumkonzentrationsdaten auf Normalität und geschätzte Mittel für Serum-IPA-Konzentrationen verschiedener Behandlungsgruppen getestet. Wir verwendeten ein lineares gemischtes Modell, um mittlere Serum- und IPA-Konzentrationen zu vergleichen, die über Individuen gepoolt wurden. Der Ködertyp (Matrix/Blisterpackung) war neben dem Versuchstag ein fester Effekt, während die tierische ID ein Zufallseffekt war. Alle Prozeduren wurden mit einer gemeinsamen statistischen Software (Tabelle der Materialien) durchgeführt und die Signifikanz wurde mit 0,05 bewertet.

Protocol

Alle Verfahren wurden vom institutionellen Animal Care and Use Committee des USDA National Wildlife Research Center gemäß dem genehmigten Forschungsprotokoll QA-2597 genehmigt. HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt das Analyseverfahren zum Nachweis von Methyl-Iophenoxsäure im Mongooseserum. Diese Methode ist die endgültige Version eines iterativen Prozesses, der mit der Analyse von Ethyl-Iophenoxsäure in Mongooseserum begann. Bei der ersten Bewertung von Ethyl-Iophenoxsäure wurden g…

Representative Results

Repräsentative Ionenchromatogramme aus einer Me-IPA-Analyse sind in Abbildung 1dargestellt. Das Kontrollmongooseserum (Abbildung 1A) zeigt die Retentionszeit von et-IPA (Ersatzanalyt) und das Fehlen von me-IPA zur angegebenen Retentionszeit. Die Qualitätskontrollstichprobe (Abbildung 1B) veranschaulicht die basislinienliche Trennung von me-IPA von et-IPA sowie die Quantifizierer- und Qualifizierer?…

Discussion

Die für die Studien entwickelte LC-MS/MS-Methode nutzte die Selektivität der Mehrfachreaktionsüberwachung, um me-IPA und et-IPA im Mongooseserum genau zu quantifizieren. Die Selektivität der MS/MS-Erkennung ermöglichte auch ein einfaches Bereinigungsprotokoll, das sich ausschließlich auf Acetonitril stützt, um Proteine aus Demerum vor der Analyse zu fällen.

Iophenoxsäuren sind in ACN löslich, aber praktisch unlöslich in Wasser. Um Wasser aus der ACN-Extraktion auszuschließen, wurde…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde zum Teil durch das intramurale Forschungsprogramm des US Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Tollwut Management Program und IDT Biologika (Dessau-Roßlau, Deutschland) unterstützt.

Materials

Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

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Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

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