Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu
Summary
Bu protokol, insan tiroid tümörigenezinin ksenogreft ve ortotopik fare modellerini mikroRNA tabanlı inhibitör tedavileri test etmek için bir platform olarak tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, kodlamayan RNA’ların işlevini ve yeni tedavi hedefleri olarak potansiyellerini incelemek için idealdir.
Abstract
MikroRNA’lar (miRNA’lar), mRNA’ların dengesini bozabilme ve hedef mRNA’ların çevirisini inhibe etme yetenekleri sayesinde gen ekspresyonunun önemli düzenleyicileridir. Çalışmaların giderek artan sayıda kanser tanısı ve prognoz için potansiyel biyobelirteçleri olarak miRNA’lar tespit etmiş, ve aynı zamanda terapötik hedefler olarak, kanser değerlendirme ve tedavi için ekstra bir boyut ekleyerek. Tiroid kanseri bağlamında, tümörigenez sadece önemli genlerdeki mutasyonlardan değil, aynı zamanda birçok miRNA’nın aşırı ekspresyonundan da kaynaklanmaktadır. Buna göre, tiroid gen ekspresyonunun kontrolünde miRNA’ların rolü kanserde önemli bir mekanizma olarak gelişmektedir. Burada insan tümörü ksenogreft ve ortotopik fare modellerini kullanarak tiroid kanserinde tedavi yöntemi olarak miRNA inhibitörü doğumunun etkilerini incelemek için bir protokol saklıyız. GFP ve luciferase ifade kararlı tiroid tümörhücreleri mühendislik sonra, hücreler tümörler geliştirmek için çıplak fareler içine enjekte edilir, biyolüminesans takip edilebilir. Bir miRNA in vivo inhibisyonu tümör büyümesini azaltabilir ve miRNA gen hedeflerini yükseltebilir. Bu yöntem, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesine ek olarak, in vivo kararlı bir miRNA önemini değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Tiroid kanseri artan bir insidansı ile bir endokrin malignite, genel olarak iyi bir sonuç olmasına rağmen1. Bununla birlikte, bazı hastalarda tedavi edilemez ve moleküler bazlar kötü anlaşılmaktadır hastalığın agresif formları geliştirmek2.
miRNA’lar, genellikle hedef haberci RNA’ların (mRNA’lar) 3′ çevirisiz bölgesine (3’UTR) bağlanarak, mRNA bozulmasını veya çevirisel baskıyı tetikleyen, birçok dokuda gen ekspresyonunu düzenleyen 22 nükleotid-uzun kodlamayan RNA’lardır. 3.2.2 , 4. MikroRNA ekspresyonunun deregülasyonunun kanserin bir özelliği olduğunu gösteren kanıtlar artmaktadır, çünkü bu moleküller çoğalan sinyalizasyon, göç, invazyon ve metastazı modüle eder ve apoptoza karşı direnç sağlayabilir. 5,6. Son yıllarda, birçok çalışma kanser tanısı ve prognoz için potansiyel biyobelirteçler olarak miRNA’lar tespit etmiş yanı sıra terapötik hedefler7, kanser değerlendirme ve tedavisi için yeni bir boyut sağlayan.
miRNA’lar insan moleküler onkolojisinde insan tiroid neoplazmlarınınanahtaritici leri olarak 8,9,10,11,12olarak merkeze alınmıştır. MiRNA’lar arasında yukarı düzenlenmiş, miR-146b papiller tiroid karsinomu (PTC) tümörlerinde aşırı ifade edilir ve hücre proliferasyonlarını önemli ölçüde artırmış ve agresiflik ve kasvetli prognoz ile ilişkili olduğu gösterilmiştir6, 12.000.0 , 13.000 , 14.000 , 15. Ayrıca, miR-146b farklılaşma dahil çeşitli tiroid genleri düzenler12, ve ayrıca Önemli tümör baskılayıcı genler Gibi PTEN16 ve DICER117. Kanser biyolojisi önemine rağmen, miRNA tabanlı kanser tedavisi hala erken aşamalarında, ve çok az çalışma tiroid kanseri ele var – endokrin tümörlerin en sık18. Burada insan kaynaklı tümörler ile iki farklı fare modelleri kullanarak bir protokol tarif, hangi sentetik bir miRNA inhibitörü uygulanması (antagomiR) özellikle bir hücresel miRNA tümör büyümesini engelleyebilir. İlk olarak ortak bir ksenogreft modeli kullandık ve antagomir’in lokal intratümör uygulaması tümör biyolüminesansında azalma olarak ölçülen tümör büyümesini azalttı16. İnsan tümörü ilerlemesini taklit eden sağlam fare modellerinin oluşturulması benzersiz terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gerekli olduğundan, primer insan tümörlerinin ortotopik implantasyonu yeni ilaçların klinik doğrulaması için daha değerli bir platformdur. deri altı implantasyon modelleri. Böylece, antagomir terapötik potansiyelini daha iyi değerlendirmek için, aynı sonuçları elde, kan dolaşımında sistemik doğum ile bir ortotopik fare modeli kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, tümör inisiyasyonu ve ilerlemesindeki rolünü ve tiroid kanserinde tedavi edici bir hedef olarak potansiyelini daha iyi anlamak için miRNA’nın in vivo fonksiyonunu incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan tümör ksenogreft modelleri, biyolüminesans sinyali ile izlenebilen hücrelerin kullanımına dayanmaktadır ve bir tedavinin etkisi altında in vivo’da tümör büyümesinin ölçülebilir. Buna ek olarak, tiroid kanseri için miRNA tabanlı bir tedavi kullanımını açıkl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Raquel Arocha Riesco’ya farelerin tedavisi ve bakımındaki yardımları için minnettarız. Biz Dr J. Blanco (Katalonya Enstitüsü Advance Chemistry-CSIC için) ve Dr E. Mato (Institut de Reserca de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barselona (İspanya) cmv-Firefly luc- IRES-EGFP ve Cal62-Luc hücreleri, sırasıyla hediye için teşekkür ederiz.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
- Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
- Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
- Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
- Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
- Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
- Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).
- Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
- Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
- Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , (2019).
- Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).
