在微RNA的Vivo抑制下，降低小鼠的肿瘤生长
Summary
该协议将人类甲状腺肿瘤的异种移植和正交小鼠模型描述为测试基于微RNA的抑制剂治疗的平台。该方法是研究非编码RNA的功能及其作为新的治疗靶点的潜力的理想选择。
Abstract
微RNA（miRNA）是基因表达的重要调节器，通过它们破坏mRNA和抑制目标mRNA的翻译的能力。越来越多的研究已经确定miRNA是癌症诊断和治疗的潜在生物标志物，也是治疗目标，为癌症评估和治疗增加了一个额外的维度。在甲状腺癌的背景下，肿瘤的产生不仅来自重要基因的突变，还来自许多miRNA的过度表达。因此，miRNA在甲状腺基因表达控制中的作用正在演变为癌症的重要机制。本文提出一个方案，利用人类肿瘤异种移植和正交小鼠模型，研究miRNA抑制剂作为甲状腺癌治疗方式的效果。在工程稳定甲状腺肿瘤细胞表达GFP和荧光素酶后，细胞被注射到裸鼠中，形成肿瘤，随后可发生生物发光。体内抑制miRNA可以降低肿瘤生长，提高miRNA基因靶点。除了确定新的治疗靶点外，该方法还可用于评估确定 miRNA 在体内的重要性。
Introduction
甲状腺癌是一种内分泌恶性肿瘤，发病率不断增加，虽然一般说来，它有很好的结果1。然而，一些患者发展为无法治疗的侵略性疾病，并且对分子基础知之甚少2。
miRNA 是 22 核苷酸长的非编码 RNA，用于调节许多组织中的基因表达，通常通过基对结合到目标信使RNA （mRNA） 的 3′ 非转化区域 （3’UTR），触发 mRNA 退化或转化抑制3,4.越来越多的证据表明，微RNA表达的放松管制是癌症的标志，因为这些分子调节增殖信号、迁移、入侵和转移，并能抵抗凋亡5，6.近年来，许多研究已经确定miRNA是癌症诊断和预后的潜在生物标志物，以及治疗目标7，为癌症评价和治疗提供了新的维度。
miRNA在人类分子肿瘤学中已成为人类甲状腺肿瘤8、9、10、11、12的关键驱动因素。在miRNA向上调节， miR-146b是高度过度表达在皮皮脑甲状腺癌 （PTC） 肿瘤， 并证明显着显著增加细胞增殖， 并与侵略性和令人沮丧的预后6，12,13,14,15.此外，miR-146b调节与分化12有关的几个甲状腺基因，以及重要的肿瘤抑制基因，如PTEN16和DICER117。尽管miRNA疗法在癌症生物学中很重要，但仍处于早期阶段，很少有研究涉及甲状腺癌——最频繁的内分泌肿瘤18。在这里，我们描述了一种协议，使用两种不同的小鼠模型与人类衍生的肿瘤，其中，一个合成miRNA抑制剂（antagomiR）的分用，专门抑制细胞miRNA可以阻止肿瘤生长。我们首先使用一种常见的异种移植模型，而一种拮抗性肿瘤的局部肿瘤内管理降低了肿瘤的生长，测量为肿瘤生物发光16的减少。由于建立模仿人类肿瘤进展的强健小鼠模型对于开发独特的治疗方法至关重要，因此，原发性人类肿瘤的正射体植入是新药临床验证的更有价值的平台。皮下植入模型。因此，为了更好地评估拮抗性小鼠的治疗潜力，我们使用了在血流中系统传递的正交小鼠模型，获得了相同的结果。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文介绍了一种研究miRNA体内功能的方法，以更好地了解其在肿瘤启动和进展中的作用，以及其作为甲状腺癌治疗靶点的潜力。这里描述的肿瘤异种移植模型基于细胞的使用，这些细胞可以通过其生物发光信号进行跟踪，从而允许在治疗的影响下测量体内的肿瘤生长。此外，我们描述了使用基于miRNA的甲状腺癌治疗，目前处于早期阶段。
我们首先使用皮下异种移植模型测试了m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢拉克尔·阿罗查·里斯科在老鼠的治疗和护理方面给予的帮助。我们感谢J.Blanco博士（加泰罗尼亚高级化学研究所-CSIC）和E.Mato博士（圣克里乌圣保医院研究所）巴塞罗那（西班牙）分别赠送CMV-萤火虫luc-IRES-EGFP和Cal62-Luc细胞。
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
References
- Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
- Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
- Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).
- Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
- Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
- Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
- Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
- Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
- Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
- Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
- Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).
- Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
- Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
- Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
- Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , (2019).
- Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).
