Dit protocol beschrijft xenotransplantaatmodellen is en orthotopic Muismodellen van menselijke schildklier tumorvorming als een platform voor het testen van microRNA-gebaseerde remmer behandelingen. Deze aanpak is ideaal voor het bestuderen van de functie van niet-coderende Rna’s en hun potentieel als nieuwe therapeutische doelen.
MicroRNAs (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van genexpressie door hun vermogen om mRNA te destabiliseren en de vertaling van doelwit Mrna’s te remmen. Een toenemend aantal studies heeft miRNAs geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor de diagnose en prognose van kanker, en ook als therapeutische doelen, waardoor een extra dimensie wordt toegevoegd aan de evaluatie en behandeling van kanker. In de context van schildklierkanker leidt tumorigenese niet alleen tot mutaties in belangrijke genen, maar ook uit de overexpressie van vele Mirna’s. Dienovereenkomstig evolueert de rol van miRNAs in de controle van de schildklier genexpressie als een belangrijk mechanisme in kanker. Hierin presenteren we een protocol om de effecten van de levering van Mirna-remmers te onderzoeken als een therapeutische modaliteit bij schildklierkanker met behulp van humane tumor xenotransplantaatmodellen is en orthotopic Muismodellen. Na engineering stabiele schildklier tumorele cellen die GFP en Luciferase uitdrukken, cellen worden geïnjecteerd in naakt muizen om tumoren te ontwikkelen, die kan worden gevolgd door bioluminescentie. De in vivo remming van een miRNA kan tumorgroei en upregulate miRNA gentargets verminderen. Deze methode kan worden gebruikt om het belang van een bepaald miRNA in vivo te beoordelen, naast het identificeren van nieuwe therapeutische doelen.
Schildklierkanker is een endocriene maligniteit met een toenemende incidentie, hoewel het in algemene termen een goed resultaat heeft1. Niettemin ontwikkelen sommige patiënten agressieve vormen van de ziekte die onbehandelbaar zijn en de moleculaire basen slecht worden begrepen2.
miRNAs zijn 22-nucleotide lange niet-Codeer Rna’s die de genexpressie in veel weefsels reguleren, meestal door de binding van het basis koppel aan de 3 ‘ untranslational Region (3 ‘ UTR) van de target Messenger Rna’s (Mrna’s), waardoor mRNA-degradatie of translationele onderdrukking wordt geactiveerd 3 , 4. er is toenemend bewijs dat aantoont dat de deregulering van de microRNA-uitdrukking een kenmerk is van kanker, aangezien deze moleculen proliferatieve signalering, migratie, invasie en metastase moduleren en resistentie kunnen bieden tegen apoptosis 5,6. In de afgelopen jaren hebben veel studies miRNAs geïdentificeerd als potentiële biomarkers voor kankerdiagnose en prognose, evenals therapeutische doelstellingen7, die een nieuwe dimensie bieden aan de evaluatie en behandeling van kanker.
miRNAs heeft een centrale plaats in humane moleculaire oncologie als belangrijkste drijfnetten voor menselijke schildklier tumoren8,9, 10,11,12. Onder de miRNAs up-gereguleerd, is miR-146b sterk overuitgedrukt in papillaire schildkliercarcinoom (PTC) tumoren en bleek de celproliferatie significant te verhogen en geassocieerd te worden met agressiviteit en Dismal prognose6, 12 , 13 , 14 , 15. Bovendien regelt miR-146b verschillende schildklier genen die betrokken zijn bij differentiatie12, en ook belangrijke tumor SUPPRESSOR genen zoals PTEN16 en DICER117. Ondanks hun belang in de Kankerbiologie, miRNA gebaseerde kankertherapie is nog in zijn vroege stadia, en zeer weinig studies hebben aangepakt schildklierkanker-de meest frequente van de endocriene tumoren18. Hier beschrijven we een protocol met behulp van twee verschillende Muismodellen met mens-afgeleide tumoren, waarin de toediening van een synthetische miRNA-remmer (antagomiR) die specifiek een cellulaire miRNA remt kan tumorgroei blokkeren. We eerst gebruikt een gemeenschappelijk xenotransplantaatmodellen is model, en de lokale intratumor administratie van een antagomir verminderde tumorgroei gemeten als een afname van de tumor bioluminescentie16. Omdat de oprichting van robuuste Muismodellen die de menselijke tumorprogressie nabootsen essentieel is om unieke therapeutische benaderingen te ontwikkelen, is orthotopic implantatie van primaire menselijke tumoren een waardevoller platform voor klinische validering van nieuwe geneesmiddelen dan subcutane implantatie modellen. Om het therapeutische potentieel van de antagomiR beter te kunnen beoordelen, gebruikten we dus een orthotopic muismodel met systemische toevoer in de bloedstroom, waarbij dezelfde resultaten werden verkregen.
Dit artikel beschrijft een methode voor het bestuderen van de in vivo functie van een miRNA om beter te begrijpen zijn rol in tumor initiatie en progressie, en zijn potentieel als een therapeutisch doelwit in schildklierkanker. De tumor xenotransplantaatmodellen is modellen hier beschreven zijn gebaseerd op het gebruik van cellen die kunnen worden gevolgd door hun bioluminescentie signaal, waardoor de meting van tumorgroei in vivo onder invloed van een behandeling. Daarnaast beschrijven we het gebruik van een miRNA-gebas…
The authors have nothing to disclose.
We zijn Raquel Arocha Riesco dankbaar voor haar hulp bij de behandeling en verzorging van muizen. Wij danken Dr. J. Blanco (Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC) en Dr. E. Mato (Institut de reserca de l’Hospital de La Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Spanje) voor het feest cadeaus van respectievelijk de cellen CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP en Cal62-Luc.
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |