In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos
Summary
Este protocolo descreve o xenograft e os modelos transplantação orthotopic do do rato do tumorigênese humano do tiróide como uma plataforma para testar tratamentos microRNA-baseados do inibidor. Esta abordagem é ideal para estudar a função de RNAs não codificantes e seu potencial como novos alvos terapêuticos.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica através de sua capacidade de destabilizar o mRNA e inibir a tradução de mRNAs alvo. Um número cada vez maior de estudos identificou miRNAs como potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico do câncer, e também como alvos terapêuticos, acrescentando uma dimensão extra à avaliação e tratamento do câncer. No contexto do cancro de tiróide, os resultados do tumorigênese não somente das mutações em genes importantes, mas igualmente da superexpressão de muitos miRNAs. Assim, o papel do miRNAs no controle da expressão gênica da tireoide está evoluindo como um importante mecanismo de câncer. Nisto, nós apresentamos um protocolo para examinar os efeitos da entrega do Mirna-inibidor como uma modalidade terapêutica no cancro de tiróide usando o xenograft humano do tumor e os modelos transplantação orthotopic do do rato. Após a engenharia de células tumorais estáveis da tireóide expressando GFP e luciferase, as células são injetadas em camundongos nus para desenvolver tumores, que podem ser seguidos por bioluminescência. A inibição in vivo de um miRNA pode reduzir o crescimento do tumor e upregulate alvos do gene de miRNA. Este método pode ser utilizado para avaliar a importância de um determinado miRNA in vivo, além de identificar novos alvos terapêuticos.
Introduction
O câncer de tireóide é uma malignidade endócrina com uma incidência crescente, embora, em termos gerais, tenha um bom desfecho1. No entanto, alguns pacientes desenvolvem formas agressivas da doença que são intratáveis e as bases moleculares são pouco compreendidas2.
miRNAs são 22-nucleotídeo-longo não-codificando RNAs que regulam a expressão de gene em muitos tecidos, tipicamente pela ligação do par-base à 3 ‘ região untranslational (3 ‘ UTR) do mensageiro do alvo RNAs (mRNAs), provocando a degradação do mRNA ou a repressão translacional 3. º , 4. There está aumentando a evidência que demonstra que a desregulamentação da expressão de microRNA é uma indicação do cancro, porque estas moléculas modulam a sinalização proliferativa, a migração, a invasão e a metástase, e podem fornecer a resistência ao apoptose 5,6. Nos últimos anos, muitos estudos identificaram miRNAs como potenciais biomarcadores para diagnóstico de câncer e prognóstico, bem como alvos terapêuticos7, proporcionando uma nova dimensão à avaliação e tratamento do câncer.
miRNAs tomaram o estágio Center na Oncologia molecular humana como os excitadores chaves de neoplasma humanos8,9,10,11,12datiróide. Entre os miRNAs acima-regulados, miR-146B é altamente overexpressado em tumores Papillary do carcinoma do tiróide (PTC) e foi mostrado para aumentar significativamente a proliferação de pilha, e para ser associado com a agressividade e o prognóstico sombrio6, 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de , 15. Além disso, miR-146B regula vários genes da tireóide envolvidos na diferenciação12, e também importantes genes supressores de tumor, como PTEN16 e DICER117. Apesar de sua importância na biologia do câncer, a terapia oncológica baseada em miRNA ainda está em seus estágios iniciais, e muito poucos estudos abordaram o câncer de tireóide-o mais frequente dos tumores endócrinos18. Aqui nós descrevemos um protocolo usando dois modelos diferentes do rato com os tumores humano-derivados, em que a administração de um miRNA-inibidor sintético (antagomiR) que inibe especificamente um miRNA celular pode obstruir o crescimento do tumor. Nós usamos primeiramente um modelo comum do xenograft, e a administração local do intratumorais de um antagomir diminuiu o crescimento do tumor medido como uma redução no bioluminescência16do tumor. Porque o estabelecimento de modelos robustos do rato que imita a progressão humana do tumor é essencial desenvolver aproximações terapêuticas originais, a implantação transplantação orthotopic do de tumores humanos preliminares é uma plataforma mais valiosa para a validação clínica de drogas novas do que modelos de implante subcutâneo. Assim, a fim de melhor avaliar o potencial terapêutico do antagomiR, utilizou-se um modelo de camundongo ortotópico com parto sistêmico na corrente sanguínea, obtendo os mesmos resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve um método para estudar a função in vivo de um miRNA a fim compreender melhor seu papel na iniciação e na progressão do tumor, e em seu potencial como um alvo terapêutico no cancro de tiróide. Os modelos do xenograft do tumor descritos aqui são baseados no uso das pilhas que podem ser controladas por seu sinal do bioluminescência, permitindo a medida do crescimento do tumor in vivo a influência de um tratamento. Além disso, descrevemos o uso de um tratamento baseado em miRNA para o câncer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Raquel arocha Riesco por sua assistência com o tratamento e cuidado de camundongos. Agradecemos ao Dr. J. Blanco (Instituto Catalonian de química antecipada-CSIC) e ao Dr. e. mato (Institut de Reserca de l’ Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Espanha) por gifting as células CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP e Cal62-Luc, respectivamente.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
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