In Vivo Hemmung von MicroRNA zur Verringerung des Tumorwachstums bei Mäusen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Xenograft- und orthotopische Mausmodelle der menschlichen Schilddrüsentumorigenese als Plattform, um mikroRNA-basierte Inhibitorbehandlungen zu testen. Dieser Ansatz ist ideal, um die Funktion nicht-kodierender RNAs und ihr Potenzial als neue therapeutische Ziele zu untersuchen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression durch ihre Fähigkeit, mRNA zu destabilisieren und die Translation von Ziel-mRNAs zu hemmen. Eine ständig wachsende Anzahl von Studien hat miRNAs als potenzielle Biomarker für die Krebsdiagnose und -prognose sowie als therapeutische Ziele identifiziert, was der Krebsbewertung und -behandlung eine zusätzliche Dimension hinzufügt. Im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs resultiert die Tumorgenese nicht nur aus Mutationen in wichtigen Genen, sondern auch aus der Überexpression vieler miRNAs. Dementsprechend entwickelt sich die Rolle von miRNAs bei der Kontrolle der Schilddrüsen-Genexpression als wichtiger Mechanismus bei Krebs. Hierbei stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirkung der miRNA-Hemmer-Verabreichung als therapeutische Modalität bei Schilddrüsenkrebs mit menschlichen Tumor-Xenograft- und orthotopischen Mausmodellen zu untersuchen. Nach der Entwicklung stabiler Schilddrüsentumorzellen, die GFP und Luziferase exezieren, werden Zellen in nackte Mäuse injiziert, um Tumore zu entwickeln, denen Biolumineszenz folgen kann. Die In-vivo-Hemmung einer miRNA kann das Tumorwachstum reduzieren und miRNA-Genziele hochregulieren. Diese Methode kann verwendet werden, um die Bedeutung einer bestimmten miRNA in vivo zu bewerten, zusätzlich zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele.
Introduction
Schilddrüsenkrebs ist eine endokrine Malignität mit zunehmender Inzidenz, obwohl sie im Allgemeinen ein gutes Ergebnis hat1. Dennoch entwickeln einige Patienten aggressive Formen der Krankheit, die nicht behandelbar sind und die molekularen Grundlagen sind schlecht verstanden2.
miRNAs sind 22-Nukleotid-lange nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression in vielen Geweben regulieren, typischerweise durch Basispaarbindung an die 3′ untranslationale Region (3’UTR) von Target Messenger RNAs (mRNAs), die mRNA-Abbau oder translationale Repression auslösen 3 , 4. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Deregulierung der microRNA-Expression ein Kennzeichen von Krebs ist, da diese Moleküle proliferative Signalisierung, Migration, Invasion und Metastasierung modulieren und Resistenzen gegen Apoptose bieten können. 5,6. In den letzten Jahren haben viele Studien miRNAs als potenzielle Biomarker für die Krebsdiagnose und -prognose sowie therapeutische Ziele7identifiziert, die eine neue Dimension für die Krebsbewertung und -behandlung bieten.
miRNAs haben in der humanen molekularen Onkologie als Schlüsseltreiber der menschlichen Schilddrüsenneoplasmen8,9,10,11,12. Unter den miRNAs up-reguliert, miR-146b ist stark überexprimiert in Papillarschildkarzinom (PTC) Tumoren und wurde gezeigt, dass signifikant erhöhen Zellproliferation, und mit Aggressivität und trostlosen Prognose assoziiert werden6, 12 , 13 , 14 , 15. Darüber hinaus reguliert miR-146b mehrere Schilddrüsengene, die an der Differenzierung beteiligt sind12, sowie wichtige Tumorsuppressorgene wie PTEN16 und DICER117. Trotz ihrer Bedeutung in der Krebsbiologie befindet sich die miRNA-basierte Krebstherapie noch in den Anfängen, und nur sehr wenige Studien haben sich mit Schilddrüsenkrebs befasst – der häufigste der endokrinen Tumoren18. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit zwei verschiedenen Mausmodellen mit vom Menschen abgeleiteten Tumoren, bei dem die Verabreichung eines synthetischen miRNA-Hemmers (AntagomiR), der speziell eine zelluläre miRNA hemmt, das Tumorwachstum blockieren kann. Wir verwendeten zuerst ein gemeinsames Xenograft-Modell, und die lokale Intratumor-Verabreichung eines AntagomiR verringerte das Tumorwachstum gemessen als eine Reduktion der Tumorbiolumineszenz16. Da die Etablierung robuster Mausmodelle, die die Progression des menschlichen Tumors imitieren, unerlässlich ist, um einzigartige therapeutische Ansätze zu entwickeln, ist die orthotopische Implantation primärer menschlicher Tumoren eine wertvollere Plattform für die klinische Validierung neuer Medikamente als subkutane Implantationsmodelle. Um das therapeutische Potenzial der AntagomiR besser einschätzen zu können, haben wir daher ein orthotopisches Mausmodell mit systemischer Entbindung im Blutstrom verwendet, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung der In-vivo-Funktion einer miRNA, um ihre Rolle bei der Tumorinitiierung und -progression und ihr Potenzial als therapeutisches Ziel bei Schilddrüsenkrebs besser zu verstehen. Die hier beschriebenen Tumor-Xenograft-Modelle basieren auf der Verwendung von Zellen, die durch ihr Biolumineszenzsignal verfolgt werden können, was die Messung des Tumorwachstums in vivo unter dem Einfluss einer Behandlung ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Verwendung einer m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Raquel Arocha Riesco für ihre Unterstützung bei der Behandlung und Pflege von Mäusen. Wir danken Dr. J. Blanco (Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC) und Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l’Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Spanien) für die Schenkung der CMV-Firefly luc- IRES-EGFP bzw. Cal62-Luc Zellen.
Materials
| AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
| Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
| DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
| In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
| In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
| Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
| PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
| PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
| XenoLight D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
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