Co de tinción de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en el tejido adiposo
Summary
Formación de vasos sanguíneos y la inervación simpática juegan papeles fundamentales en la remodelación del tejido adiposo. Sin embargo, quedan cuestiones técnicas en visualizar y medir cuantitativamente el tejido adiposo. Aquí presentamos un protocolo para etiquetar correctamente y comparar cuantitativamente la densidad de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en diferentes tejidos adiposos.
Abstract
Estudios recientes han puesto de relieve el papel fundamental de la angiogénesis y la inervación simpática en el tejido adiposo remodelación durante el desarrollo de la obesidad. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método fácil y eficiente para documentar los cambios dinámicos en el tejido adiposo. Aquí, describimos un método inmunofluorescente modificado que eficientemente Co las manchas de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en los tejidos adiposos. En comparación con los métodos tradicionales y recientemente desarrollados, nuestro enfoque es relativamente fácil de seguir y más eficiente en el etiquetado de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas con densidades más altas y menos fondo. Por otra parte, la mayor resolución de las imágenes más nos permite medir con precisión el área de los vasos, la cantidad de ramificaciones y la longitud de las fibras por el software de código abierto. Como una demostración con nuestro método, mostramos que el tejido adiposo marrón (BAT) contiene cantidades más altas de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en comparación con el tejido adiposo blanco (WAT). Somos además encontrar que entre los WATs, WAT subcutáneo (sWAT) tiene más los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en comparación con el epidídimo WAT (eWAT). Nuestro método proporciona así una herramienta útil para la investigación de remodelación del tejido adiposo.
Introduction
El tejido adiposo tiene clave metabólica y endocrina funciones1. Dinámicamente se expande o se contrae en respuesta a diferentes nutrientes destaca2. El tejido activo proceso de remodelación consta de múltiples caminos, escalones fisiológicas incluyendo angiogénesis, fibrosis y formación de microambientes inflamatorios locales2,3,4. Algunos estímulos físicos, como la exposición fría y ejercicio, pueden desencadenar la activación simpática, que en última instancia conduce a la formación de vasos sanguíneos y la inervación simpática en el tejido adiposo5,6. Estos procesos de remodelación están vinculados estrechamente a los resultados metabólicos sistémicos incluyendo sensibilidad a la insulina, el sello del tipo 2 diabetes2. Así, la visualización de estos cambios patológicos es muy importante para entender el estado saludable de todo los tejidos adiposos.
La angiogénesis es el proceso de formación de vasos sanguíneos nuevos. Ya que los vasos sanguíneos proveen oxígeno, nutrientes, hormonas y factores de crecimiento al tejido, la angiogénesis se ha considerado un paso clave en la remodelación del tejido adiposo, que se ha documentado con diferentes técnicas6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. sin embargo, quedan preguntas sobre la resolución de las imágenes, la eficiencia de inmunotinción y métodos para la cuantificación de la densidad de vasos. En comparación con la formación de vasos sanguíneos, inervación en el tejido adiposo ha subestimado durante mucho tiempo. Recientemente, Zeng et al. 14 utilizada avanzada microscopía de dos fotones intravital y demostró que los adipocitos están rodeados por capas de fibras nerviosas14. Desde entonces, los investigadores han comenzado a apreciar el papel fundamental de la inervación simpática en la regulación de la fisiología del tejido adiposo. Por lo tanto, es importante desarrollar un enfoque fácil y práctico a la inervación del nervio adiposo documento.
Aquí, Divulgamos un método optimizado para co tinción de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas basadas en los protocolos anteriores. Con este método, podemos lograr imágenes claras de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas sin fondo ruidoso. Por otra parte, obtenemos una resolución lo suficientemente alta para realizar la medición cuantitativa de las densidades con software de código abierto. Mediante el uso de este nuevo enfoque, con éxito podemos comparar las estructuras y densidades de los vasos sanguíneos y fibras nerviosas en diferentes depósitos adiposos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Remodelación del tejido adiposo está directamente ligado al dysregulation metabólico durante el desarrollo de obesidad1,2. Angiogénesis e inervación simpática son esenciales para el proceso remodelación dinámica2,12. Por lo tanto, un enfoque aplicable para visualizar los vasos sanguíneos así como fibras nerviosas son de gran importancia. Los métodos anteriores se han divulgado para documentar l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de salud (NIH) subsidio R01DK109001 (K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
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