Summary

Co a coloração dos vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo

Published: February 13, 2019
doi:

Summary

Formação da embarcação de sangue novo e inervação simpática desempenham um papel crucial na remodelação do tecido adiposo. No entanto, subsistem questões técnicas em Visualizar e medir quantitativamente o tecido adiposo. Aqui nós apresentamos um protocolo para rotular com êxito e comparar quantitativamente as densidades de vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferentes tecidos adiposos.

Abstract

Estudos recentes têm destacado o papel crítico da angiogênese e inervação simpática no tecido adiposo remodelação durante o desenvolvimento da obesidade. Portanto, desenvolver um método fácil e eficiente para documentar as mudanças dinâmicas no tecido adiposo é necessário. Aqui, descrevemos uma abordagem de imunofluorescência modificada que eficientemente co manchas, vasos sanguíneos e fibras nervosas no tecido adiposo. Em comparação com métodos tradicionais e recentemente desenvolvidos, nossa abordagem é relativamente fácil de seguir e mais eficiente na rotulagem dos vasos sanguíneos e fibras nervosas com densidades maiores e menos fundo. Além disso, quanto maior a resolução das imagens ainda mais nos permite medir com precisão a área dos navios, quantidade de ramificação e comprimento das fibras por software de código aberto. Como uma demonstração usando o nosso método, mostramos que o tecido adiposo marrom (BAT) contém quantidades mais elevadas de vasos sanguíneos e fibras nervosas em relação ao tecido adiposo branco (WAT). Podemos ainda encontrar que entre os WATs, WAT subcutâneo (sWAT) tem mais vasos sanguíneos e fibras nervosas em relação ao epidídimo WAT (eWAT). Nosso método, portanto, fornece uma ferramenta útil para investigar a remodelação do tecido adiposo.

Introduction

Tecido adiposo tem chave metabólica e endócrina funções1. Isso dinamicamente aumenta ou diminui em resposta a diferentes nutrientes sublinha2. O tecido ativo processo de remodelação é composto por vários caminhos fisiológicas/etapas incluindo angiogênese, fibrose e formação de um microambiente inflamatório local2,3,4. Alguns estímulos físicos, tais como exposição fria e exercício, podem desencadear a ativação simpática, que em última análise, leva à formação de embarcação de sangue novo e inervação simpática em tecidos adiposos5,6. Estes processos de remodelação estão ligados firmemente a resultados metabólicos sistêmicos, incluindo a sensibilidade à insulina, a marca do tipo 2 diabetes2. Assim, a visualização dessas alterações patológicas é muito importante para compreender o estado saudável dos tecidos adiposos.

Angiogênese é o processo de formação da embarcação de sangue novo. Uma vez que os vasos sanguíneos fornecer oxigênio, nutrientes, hormônios e fatores de crescimento para o tecido, angiogênese foi considerado um passo fundamental no tecido adiposo remodelação, que tem sido documentado com diferentes técnicas6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. no entanto, subsistem dúvidas sobre a resolução das imagens, eficiência de imunocoloração e métodos para a quantificação da densidade do navio. Em relação à formação da embarcação de sangue novo, inervação no tecido adiposo foi subestimada por muito tempo. Recentemente, Zeng et al. 14 usado avançados de microscopia intravital dois fotões e demonstrou que os adipócitos estão cercados por camadas de fibras nervosas14. Desde então, os pesquisadores começaram a apreciar o papel fulcral da inervação simpática no Regulamento da fisiologia do tecido adiposo. Assim, desenvolver uma abordagem fácil e prática de inervação do nervo adiposa de documento é importante.

Aqui, nós relatamos um método otimizado para a coloração co de vasos sanguíneos e fibras nervosas, com base em nossos protocolos anteriores. Com este método, podemos conseguir imagens claras de vasos sanguíneos e fibras nervosas sem fundo ruidoso. Além disso, nós obtemos uma resolução que é alta o suficiente para executar a medição quantitativa de densidades com software de código aberto. Usando esta nova abordagem, podemos comparar com sucesso as estruturas e as densidades de vasos sanguíneos e fibras nervosas em diferentes depósitos adiposos.

Protocol

Todos os procedimentos que contenham assuntos animais foram aprovados pelo centro de Ciências de Saúde Animal Welfare Comitê da Universidade do Texas em Houston (número de protocolo animal: AWC-18-0057). 1. preparação do reagente 1 x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4): para fazer 1 L de PBS 1x, dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4e 0,24 g de KH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajustar o pH para 7,4 e encha com ág…

Representative Results

A região distal do epidídimo tecido adiposo branco (eWAT), região medial do dorsolombar branco tecido adiposo subcutâneo (sWAT) e região medial da interscapulaire tecido adiposo marrom (BAT) foram coletados. Os locais de recolha desses tecidos são indicados na Figura 1. Figura 1: Anatomia do tecido adip…

Discussion

Remodela o tecido adiposo está diretamente ligada à desregulação metabólica durante o desenvolvimento de obesidade1,2. Angiogênese e inervação simpática são essenciais para a dinâmica remodela processo2,12. Portanto, desenvolver uma abordagem aplicável para visualizar os novos vasos sanguíneos, bem como as fibras nervosas são de grande importância. Métodos anteriores têm sido relatados pa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi suportado pelo Instituto Nacional de saúde (NIH) grant R01DK109001 (K.S.).

Materials

Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 805-545-180 Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Lot: 121944
Amira 6.0 Thermo Fisher Scientific Licensed software
Angio tool National Institutes of Health Open source software
https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody R&D research system AF4666 Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody Pel Freez Biologicals P40101-150 Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D=0.17mm Zeiss 474030-9020-000
Cytoseal 280 Thermo Fisher Scientific 8311-4 High-viscosity medium
Glycerol Fisher G33-500
Paraformaldehyde,16% TED PELLA 170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep INVITROGEN P24744 Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36965 Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer Thermo Fisher Scientific 37527X3
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes Thermo Fisher Scientific 22-272416
Triton Χ-100 Sigma-Aldrich X100 Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries VWR 10136-084
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Generic term: Polysorbate 20

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Cite This Article
Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59266, doi:10.3791/59266 (2019).

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