Summary

Co Färbung Blutgefäße und Nervenfasern im Fettgewebe

Published: February 13, 2019
doi:

Summary

New Schiff Blutbildung und sympathische Innervation spielen entscheidende Rolle im Fettgewebe, das umgestaltet. Es bleiben jedoch technische Probleme zu visualisieren und Fettgewebe quantitativ zu messen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um erfolgreich zu kennzeichnen und quantitativ vergleichen die dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in verschiedenen Fettgewebe.

Abstract

Neuere Studien haben deutlich gemacht, dass die kritische Rolle der Angiogenese und sympathische Innervation im Fettgewebe Umbau bei der Entwicklung von Fettleibigkeit. Daher ist es notwendig, eine einfache und effiziente Methode, um die dynamischen Veränderungen im Fettgewebe dokumentieren zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen modifizierten immunofluorescent Ansatz, der effizient Blutgefäße und Nervenfasern in Fettgewebe Co Flecken. Im Vergleich zu traditionellen und neu entwickelte Methoden, ist unser Ansatz relativ einfach zu folgen und effizienter bei der Kennzeichnung der Blutgefäße und Nervenfasern mit höherer Dichte und weniger Hintergrund. Darüber hinaus ermöglicht die höhere Auflösung der Bilder weiter Bereich der Schiffe, die Höhe der Verzweigung und die Länge der Fasern durch open-Source-Software genau zu messen. Als eine Demonstration, die mit unserer Methode zeigen wir, dass diese braune Fettgewebe (BAT) höhere Mengen an Blutgefäßen und Nervenfasern im Vergleich zu weißen Fettgewebe (WAT) enthält. Wir ferner feststellen, dass unter die WATs, subkutane WAT (sWAT) mehr Blutgefäße und Nervenfasern im Vergleich zu epididymal WAT (eWAT) hat. Unsere Methode bietet somit ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Fettgewebe umgestaltet.

Introduction

Fettgewebe hat Schlüssel metabolische und endokrine Funktionen1. Es dynamisch erweitert oder verkleinert als Reaktion auf verschiedene Nährstoff betont2. Das aktive Gewebe Umbau Prozess besteht aus mehreren physiologischen Wege/Schritte einschließlich der Angiogenese, Fibrose und Gestaltung der lokalen entzündlichen Mikroumgebungen2,3,4. Einige körperliche Reize, wie kalte Belichtung und Übung können sympathische Aktivierung auslösen, führt letztlich zu neuen Schiff Blutbildung und sympathische Innervation im Fettgewebe5,6. Diese Umgestaltung Prozesse sind systemische metabolische Ergebnisse einschließlich Insulin-Empfindlichkeit, das Markenzeichen des Typ 2 Diabetes2eng verbunden. Visualisierung dieser pathologischen Veränderungen sind deshalb sehr wichtig für das Verständnis des gesunden Status des gesamten Fettgewebe.

Angiogenese ist der Prozess des neuen Schiffes Blutbildung. Da Blutgefäße Sauerstoff, Nährstoffe, Hormone und Wachstumsfaktoren Gewebe liefern, Angiogenese einen wichtigen Schritt im Fettgewebe, das umgestaltet, galt die mit verschiedenen Techniken6,7, dokumentiert ist 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. jedoch bleiben Fragen über die Auflösung der Bilder, die Effizienz der Immunostaining und Methoden zur Quantifizierung des Schiffes Dichte. Im Vergleich zu New Schiff Blutbildung, ist Innervation im Fettgewebe für eine lange Zeit unterschätzt worden. Vor kurzem, Zeng Et Al. 14 verwendet erweiterte intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie und gezeigt, dass Schichten von Nervenfasern14Adipozyten umgeben sind. Seither haben Forscher begonnen, die zentrale Rolle der sympathischen Innervation bei Regulierung der Fettgewebe Physiologie zu schätzen wissen. Daher ist es wichtig, einen einfachen und praktische Ansatz für Dokument adipösen Nerv Innervation zu entwickeln.

Hier berichten wir über eine optimierte Methode für die Co-Färbung von Blutgefäßen und Nervenfasern auf unsere früheren Protokollen basierende. Mit dieser Methode erreichen wir klare Bilder von Blutgefäßen und Nervenfasern ohne lauten Hintergrund. Darüber hinaus erhalten wir eine Resolution, die hoch genug ist für die Durchführung von quantitativen Messung der Dichte mit open-Source-Software. Mithilfe dieses neuen Ansatzes können wir erfolgreich die Strukturen und dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in den verschiedenen adipose Depots vergleichen.

Protocol

Alle Verfahren, die enthalten tierischer Themen von der Animal Welfare Committee der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt worden (tierische Protokollnummer: AWC-18-0057). (1) Reagenz Vorbereitung 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4): um 1 L 1 X PBS zu machen, auflösen, 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na2HPO40,24 g KH2PO4 in 800 mL destilliertem Wasser. Anpassen des pH-Werts 7,4 und füllt mit desti…

Representative Results

Die distalen Region epididymal weißen Fettgewebe (eWAT), mediale Region des Dorsolumbar subkutane weißen Fettgewebes (sWAT) und medialen Region Interskapuläre braunen Fettgewebe (BAT) wurden gesammelt. Die Standorte für die Erhebung dieser Gewebe sind in Abbildung 1angegeben. Abbildung 1: Anatomie des sub…

Discussion

Fettgewebe Umbau knüpft direkt an metabolischen Dysregulation bei Adipositas Entwicklung1,2. Angiogenese und sympathische Innervation sind unerlässlich für die dynamische umgestaltet Prozess2,12. Daher eines anwendbaren Ansatzes um die Bildung neuer Blutgefäße sowie Nervenfasern zu visualisieren sind von großer Bedeutung. Bisherige Methoden zur Dokumentation von Angiogenese im Fettgewebe berichtet. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Health (NIH) Grant R01DK109001 (k.s.).

Materials

Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 805-545-180 Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Lot: 121944
Amira 6.0 Thermo Fisher Scientific Licensed software
Angio tool National Institutes of Health Open source software
https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody R&D research system AF4666 Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody Pel Freez Biologicals P40101-150 Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D=0.17mm Zeiss 474030-9020-000
Cytoseal 280 Thermo Fisher Scientific 8311-4 High-viscosity medium
Glycerol Fisher G33-500
Paraformaldehyde,16% TED PELLA 170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep INVITROGEN P24744 Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36965 Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer Thermo Fisher Scientific 37527X3
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes Thermo Fisher Scientific 22-272416
Triton Χ-100 Sigma-Aldrich X100 Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries VWR 10136-084
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Generic term: Polysorbate 20

References

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  3. Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
  4. Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
  5. Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
  6. Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
  7. Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
  8. Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
  9. During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
  10. Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
  11. Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
  12. Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
  13. Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
  14. Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  16. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
  17. Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
  18. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  19. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  20. An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
  21. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).

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Cite This Article
Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59266, doi:10.3791/59266 (2019).

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