Summary

Co-macchiatura dei vasi sanguigni e fibre nervose nel tessuto adiposo

Published: February 13, 2019
doi:

Summary

Formazione del vaso sanguigno di nuovo e lo stimolo simpatico svolgono un ruolo fondamentale nel rimodellamento del tessuto adiposo. Tuttavia, permangono problemi tecnici nella visualizzazione e quantitativamente misurando il tessuto adiposo. Qui presentiamo un protocollo per etichettare correttamente e confrontare quantitativamente le densità dei vasi sanguigni e fibre nervose in diversi tessuti adiposi.

Abstract

Recenti studi hanno evidenziato il ruolo critico dell’angiogenesi e stimolo simpatico nel rimodellamento del tessuto adiposo durante lo sviluppo dell’obesità. Pertanto, lo sviluppo di un metodo semplice ed efficace per documentare i cambiamenti dinamici nel tessuto adiposo è necessario. Qui, descriviamo un metodo immunofluorescente modificato che efficacemente co-macchie vasi sanguigni e fibre nervose in tessuti adiposi. Rispetto ai metodi tradizionali e sviluppati di recente, il nostro approccio è relativamente facile da seguire e più efficiente in etichettatura i vasi sanguigni e fibre nervose con densità più elevate e meno lo sfondo. Inoltre, la maggiore risoluzione delle immagini ulteriormente permette di misurare con precisione la zona dei vasi, la quantità di ramificazione e dalla lunghezza delle fibre di software open source. Come una dimostrazione con il nostro metodo, vi indichiamo che il tessuto adiposo marrone (pipistrello) contiene una maggiore quantità di vasi sanguigni e fibre nervose rispetto al tessuto adiposo bianco (WAT). Inoltre trovare che tra i Wat, WAT sottocutaneo (sWAT) ha più vasi sanguigni e fibre nervose rispetto al WAT epididimaria (eWAT). Il nostro metodo fornisce pertanto uno strumento utile per indagare il rimodellamento del tessuto adiposo.

Introduction

Tessuto adiposo ha chiave metabolica ed endocrina funzioni1. Si espande o si contrae in risposta a differenti dinamicamente nutriente sottolinea2. Il tessuto attivo processo di rimodellamento è costituito da più percorsi/passaggi fisiologici tra cui l’angiogenesi, la fibrosi e la modellatura di microambienti infiammatoria locale2,3,4. Alcuni stimoli fisici, quali esposizione al freddo e l’esercizio, possono innescare l’attivazione simpatica, che infine conduce alla formazione del vaso sanguigno di nuovo e lo stimolo simpatico in tessuti adiposi5,6. Questi processi di rimodellamento sono collegati strettamente ai risultati metabolici sistemici compreso la sensibilità dell’insulina, il segno distintivo di tipo 2 il diabete2. Così, la visualizzazione di queste mutazioni patologiche è molto importante per comprendere lo stato integro di interi tessuti adiposi.

L’angiogenesi è il processo di formazione del vaso sanguigno di nuovo. Poiché i vasi sanguigni fornire ossigeno, nutrienti, ormoni e fattori di crescita del tessuto, l’angiogenesi è stata considerata un passo fondamentale nel rimodellamento del tessuto adiposo, che è stato documentato con tecniche differenti6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Tuttavia, persistono dubbi la risoluzione delle immagini, efficienza di immunostaining e metodi per la quantificazione della densità della nave. Rispetto alla formazione del vaso sanguigno di nuovo, lo stimolo nel tessuto adiposo è stato sottovalutato per lungo tempo. Recentemente, Zeng et al.. 14 usato avanzata videomicroscopia microscopia del due-fotone e dimostrato che adipocytes sono circondati da strati di fibre nervose14. Da allora, i ricercatori hanno iniziato ad apprezzare il ruolo fondamentale di stimolo simpatico nel regolamento della fisiologia del tessuto adiposo. È quindi importante sviluppare un approccio facile e pratico per lo stimolo del nervo adiposa documento.

Qui, segnaliamo un metodo ottimizzato per la co-colorazione dei vasi sanguigni e fibre nervose basate sui nostri protocolli precedenti. Con questo metodo, possiamo ottenere immagini chiare dei vasi sanguigni e fibre nervose senza sfondo rumoroso. Inoltre, otteniamo una risoluzione che è sufficientemente elevata per eseguire la misurazione quantitativa della densità con software open source. Utilizzando questo nuovo approccio, possiamo confrontare correttamente le strutture e la densità dei vasi sanguigni e fibre nervose in diversi depositi adiposi.

Protocol

Tutte le procedure contenenti animali soggetti sono state approvate da Animal Welfare Comitato della University of Texas Health Science Center a Houston (numero di protocollo animale: AWC-18-0057). 1. preparazione dei reagenti 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4): per rendere 1 L di PBS 1X, sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4e 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,4 e riempire con acqua di…

Representative Results

La regione distale del tessuto adiposo bianco dell’epididimo (eWAT), regione mediale di dorsolumbar bianco tessuto adiposo sottocutaneo (sWAT) e mediale regione interscapolare tessuto adiposo marrone (pipistrello) sono stati raccolti. Le posizioni per la raccolta di questi tessuti sono indicate nella Figura 1. <stron…

Discussion

Rimodellamento del tessuto adiposo è direttamente collegato al dysregulation metabolico durante lo sviluppo dell’obesità1,2. Angiogenesi e stimolo simpatico sono entrambi essenziali per il rimodellamento dinamico processo2,12. Di conseguenza, lo sviluppo di un approccio applicabile per visualizzare i nuovi vasi sanguigni così come le fibre nervose sono di grande importanza. Metodi precedenti sono stati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato sostenuto dall’Istituto nazionale di sovvenzione di salute (NIH) R01DK109001 (a K.S.).

Materials

Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 805-545-180 Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 711-605-152 Lot: 121944
Amira 6.0 Thermo Fisher Scientific Licensed software
Angio tool National Institutes of Health Open source software
https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody R&D research system AF4666 Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody Pel Freez Biologicals P40101-150 Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D=0.17mm Zeiss 474030-9020-000
Cytoseal 280 Thermo Fisher Scientific 8311-4 High-viscosity medium
Glycerol Fisher G33-500
Paraformaldehyde,16% TED PELLA 170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep INVITROGEN P24744 Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36965 Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer Thermo Fisher Scientific 37527X3
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes Thermo Fisher Scientific 22-272416
Triton Χ-100 Sigma-Aldrich X100 Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries VWR 10136-084
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Generic term: Polysorbate 20

References

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  3. Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
  4. Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
  5. Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
  6. Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
  7. Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
  8. Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
  9. During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
  10. Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
  11. Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
  12. Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
  13. Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
  14. Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  16. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
  17. Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
  18. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  19. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  20. An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
  21. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).

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Cite This Article
Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (144), e59266, doi:10.3791/59266 (2019).

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