脂肪组织中的血管和神经纤维的共染色
Summary
新的血管形成和交感神经支配在脂肪组织重塑中起着举足轻重的作用。然而, 在对脂肪组织进行可视化和定量测量方面仍然存在技术问题。在这里, 我们提出了一个协议, 以成功地标记和定量比较血管和神经纤维在不同的脂肪组织的密度。
Abstract
最近的研究强调了血管生成和交感神经支配在肥胖发展过程中脂肪组织重塑的关键作用。因此, 开发一种简单有效的方法来记录脂肪组织的动态变化是必要的。在这里, 我们描述了一种改进的免疫荧光方法, 有效地共同染色血管和神经纤维在脂肪组织。与传统和最近开发的方法相比, 我们的方法相对容易遵循, 更有效地标记密度较高、背景较少的血管和神经纤维。此外, 图像的高分辨率进一步使我们能够通过开源软件准确地测量容器的面积、分枝量和纤维长度。作为使用我们的方法的演示, 我们表明棕色脂肪组织 (bat) 含有更高的血管和神经纤维相比, 白色脂肪组织 (wat)。我们进一步发现, 在 wats 中, 皮下 wat (swat) 与附睾 (ewat) 相比, 血管和神经纤维更多。因此, 我们的方法为研究脂肪组织重构提供了一个有用的工具。
Introduction
脂肪组织具有关键的代谢和内分泌功能1。它动态膨胀或收缩, 以响应不同的养分胁迫2。活性组织重塑过程包括多种生理路径, 包括血管生成、纤维化和局部炎症微环境的形成 2,3,4。一些物理刺激, 如冷暴露和运动, 可能会触发交感神经激活, 最终导致新的血管形成和脂肪组织5,6的交感神经支配。这些重塑过程与全身代谢结果密切相关, 包括胰岛素敏感性, 2 型糖尿病的标志.因此, 这些病理改变的可视化是非常重要的了解整个脂肪组织的健康状态。
血管生成是新血管形成的过程。由于血管为组织提供氧气、营养物质、激素和生长因子, 血管生成被认为是脂肪组织重塑的关键一步, 这已被记录与不同的技术6,7,8,9,10,11,12,13. 然而, 在图像的分辨率、免疫染色的效率以及血管密度的量化方法方面仍然存在问题。与新的血管形成相比, 脂肪组织的神经支配被长期低估。最近, 曾等人.14使用先进的免疫管内双光子显微镜, 并证明脂肪细胞周围有一层神经纤维 14.从那时起, 研究人员开始认识到交感神经支配在脂肪组织生理调节中的关键作用。因此, 开发一种简单实用的方法来记录脂肪神经神经支配是非常重要的。
在这里, 我们报告了一种优化的方法, 血管和神经纤维的共染色基于我们以前的协议。通过这种方法, 我们可以在没有嘈杂背景的情况下实现血管和神经纤维的清晰图像。此外, 我们获得的分辨率足够高, 可以使用开源软件对密度进行定量测量。通过使用这种新方法, 我们可以成功地比较不同脂肪库的血管和神经纤维的结构和密度。
Protocol
Representative Results
Discussion
脂肪组织重塑与肥胖发展过程中的代谢失调直接相关 1,2。血管生成和交感神经支配对动态重塑过程2,12都是必不可少的。因此, 开发一种适用的方法来可视化新的血管以及神经纤维是非常重要的。以前的方法已经报告记录血管生成在脂肪组织。然而, 这些方法仍然存在一些问题, 包括效率低、分辨率低和背景嘈?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家卫生研究所授予 r01dk109001 (向 k. s.) 的支持。
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
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| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
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