世代、増幅、および組換え呼吸器合胞体ウイルスの滴定
Summary
生成する方法について述べる、RSVs の呼吸器合胞体ウイルス (RSVs) と最適化されたプラクの試金を変更遺伝子を増幅します。RSV レプリケーションの定量化しライブ RSV 封入体と顆粒の封入体のダイナミクスの分析、それぞれ 2 つの組換えウイルスを作成することによってこのプロトコルを示しています。
Abstract
組換えウイルスの使用は、基礎、応用のウイルス学で非常に重要になっています。逆遺伝学は、ウイルスの複製メカニズムを解読してする研究抗ウイルス薬やワクチンの開発プラットフォームを提供する両方の非常に強力な技術を実証されています。構築とマイナス鎖 RNA ウイルス呼吸器合胞体ウイルス (RSV) などの逆遺伝学的システムの操作ただし、微妙なまま、特別なノウハウが必要です。RSV ゲノム ウイルス RNA 複製と転写の両方のテンプレートとして機能する約 15 kb の一本鎖、否定的な感覚の RNA であります。私たちリバース ・ ジェネティクス システムは、人間の RSV 長い株ゲノム (HRSV) の cDNA コピーを使用します。この cDNA、Cdna 複雑なポリメラーゼのウイルス蛋白質 (L、P、N、および M2 1) と同様は、T7 ポリメラーゼ制御シーケンスの下の個々 の表現のベクトルに配置されます。T7 ポリメラーゼを安定して表現、BSR T7/5 細胞でこれらの要素のトランスフェクションにより細胞質の複製と遺伝子組換えの RSV の転写遺伝子組み換えウイルス粒子に上昇を与えます。ウイルスの増幅の HEp 2 細胞に感染する細胞表面の BSRT7/5 の培養上清中に存在である新しい RSV が収集されます。増幅の 2 つまたは 3 つのラウンドは、1 x 106 1 x 107プラーク形成単位 (PFU) を含むウイルス株を入手する必要が/mL。最適な収穫、凍結、及びウイルス株の滴定の方法は詳細のとおりです。私たちはそれぞれ無料緑色蛍光タンパク質 (GFP) (rs ウイルス ・ GFP) を表現する 2 つの遺伝子組換えウイルスを作成することによってここに示されるプロトコルを説明またはウイルス M2 1 GFP (RSV M2 1 GFP) の融合。RSV のレプリケーションおよびビデオ顕微鏡技術を用いた生細胞におけるウイルス タンパク質ダイナミクスと同様、ウイルスの構造を視覚化する RSV M2 1 GFP を定量化する rs ウイルス ・ GFP を使用する方法を示します。
Introduction
人間 RSV は、幼児の世界1入院急性上気道感染症の主要な原因です。また、RSV は成人インフルエンザ、ほとんどの入院および死亡率の負担で高齢者2と同等の実質的な疾病に関連付けられます。ないワクチンまたは特定の抗ウイルス薬まだ rsv、しかし、有望な新薬は、開発3,4。複雑さと RSV の乗算の定量化技術の重さは、抗ウイルス剤やワクチンは現在相当な努力にもかかわらずの検索を妨げます。RSV 乗算体外の定量化は一般的に骨の折れる、時間がかかり、高価なメソッドで、顕微鏡、染色、プラーク除去アッセイ、定量的細胞変性効果の解析を中心に構成に基づいてください。逆転写酵素 (qRT)-ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、酵素抗体アッセイのテスト。変更されたゲノムなどのレポーター遺伝子発現とウイルスは、GFP のコーディング、そのようなスクリーニングに適しています。自動プレート リーダーの使用を組み合わせることで、レポーター遺伝子組換えウイルスの遺伝子を運ぶことができますこれらの試標準化と高スループットのために適して。
RSV はエンベロープ、処理負センス RNA ウイルスPneumoviridae家族、順序モノネガ ウイルス目5のOrthopneumovirus属に属するです。RSV ゲノム リーダーとトレーラーと 10 転写ユニット 11 タンパク質をエンコードと呼ばれる 3′ と 5′ の四肢の非翻訳領域を含む約 15 kb の一本鎖、否定的な感覚の RNA であります。遺伝子の順序: 3′-NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2 (M2 1 そして M2 2 蛋白質のためエンコード)、L-5’。ゲノム RNA はしっかり蛋白テンプレートとして N を使用以上のゲノム RNA によってパッケージ化、ウイルスの RNA 依存した RNA ポリメラーゼ (RdRp) は転写とウイルス RNA の複製になります。ウイルスの酵素はヌクレオチド合成酵素活性をそれ自体運ぶ大きい蛋白質 L から成る、その必須の補酵素 P リン蛋白質およびウイルスの転写として機能する M2 1 蛋白質因子6。感染した細胞は、RSV は封入体 (IBs) と呼ばれる細胞質包有物の形成を誘導します。いくつかモノネガ ウイルス目7,8,9,10の類似した形態の細胞質包有物が観察されています。狂犬病ウイルス、水胞性口炎ウイルス (VSV)、エボラ ウイルス、ibs は、みなすことができる従ってウイルス工場8,9,11,ウイルスの RNA 合成が発生することを示した RSV に関する最近の研究12. ウイルス工場 RNA のウイルスの RNA 合成に必要なウイルス蛋白質の集中、また細胞蛋白質13,14,15,16,を含む17. IBs 展示集中する IB 関連顆粒 (IBAGs) と呼ばれる、機能班、新しく synthetized M2 1 蛋白質と共に新生ウイルス mRNA。ゲノム RNA と L、P、および N は、IBAGs では検出されません。IBAGs は、液体細胞小器官12の性質を示す IBs の中小さな動的球形構造です。ウイルスの増殖に IBs の中心的役割にもかかわらず自然、内部構造、形成、およびこれらのウイルスの工場の操作についてほとんど知られています。
CDNA からポリオ ウイルスのゲノムの発現には、1981年18で最初の感染ウイルスのクローンの生産が可能。一本鎖マイナス RNA ウイルスだった 1994 年まで次のプラスミドのトランスフェクション細胞19に最初の狂犬病ウイルスの生産が行われたこと。最初プラスミドを用いた逆遺伝システム RSV は 1995年20に掲載されました。逆遺伝学ウイルス学の分野に大きな進歩をもたらした。ウイルスのゲノムに特定の変更を導入する可能性は、レプリケーションおよび RNA ウイルスの病因に重要な洞察力を提供しています。この技術も大幅変更の対象となる一連の特定の減衰によりワクチンの開発を促進しています。大きく急速なウイルスの増殖の定量化を許可するゲノムの変更が改善されたは、抗ウイルスのスクリーニングとアクションの彼らのモードの研究.
説明したが微妙なまま遺伝子組み換え RSVs を取得します。ここでは、我々 はそれぞれ表現 RSV GFP や RSV M2 1 GFP 遺伝子組換えの HRSV の 2 種類を作成するためのプロトコルを詳しく説明します。このプロトコルでは高価、再現性のある実験に適したウイルス株を取得する彼らの増幅と同様、新しい遺伝子組換えウイルスを救出するために必要なトランスフェクション条件について述べる。逆遺伝学のベクトルの建設自体がないここで説明します。最適な収穫・ ウイルス株の凍結方法について述べること。ウイルスの感染性粒子を定量化する最も正確な方法のままプラクの試金。細胞分析の懸濁液のシリアル希薄に感染して、培養上清で無料のウイルス粒子の拡散を禁止するオーバーレイを使って。このような条件でセルごとの初期感染粒子の「プラーク」を形成はウイルスに感染のみ。従来の RSV 滴定分析では、プラクは免疫染色によって明らかに、顕微鏡下でカウントします。このメソッドは高価で時間がかかるです。ここで我々 は肉眼に目に見えないプラークの形成を可能にする微結晶性セルロースのオーバーレイを使用して RSV プラクの試金のための非常に単純なプロトコルを説明します。RSV レプリケーションを測定して、したがって、する、RSV GFP を使用する方法を示す抗ウイルス剤の影響を定量化します。逆遺伝学、ライブ イメージング技術を組み合わせて、RSV M2 1 GFP により生細胞における M2 1 を視覚化し、IBs などの細胞内のウイルス構造のダイナミクスに従うの科学者、方法を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで 5 つのプラスミドから組換え RSVs の救助の方法とその増幅を提案します。ウイルスのゲノムを操作する機能の突然変異をテストし、追加の遺伝子やタグ ウイルスの蛋白質を表現するウイルス学革命をもたらしました。RSV について説明し、この記事の例はレポーターの遺伝子、RSV GFP (未発表)、M2 1 タンパク質 GFP タグ12融合した表現を発現するウイルスとして使用しま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、AZD4316 医薬品を提供するためアストラゼネカ ・ R & D ボストン、マサチューセッツ州、米国から博士秦湯に感謝します。著者、Cymages プラットフォームを ScanR オリンパス顕微鏡へのアクセスに感謝してこれに支えられ地域イル (薄暗い 1 つ健康) から助成金します。著者は、INSERM とベルサイユ サンカンタンにある大学からのサポートを認めます。
Materials
| 35mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
| BSRT7/5 | not commercially available | See ref 22. Buchholz et al, 1999 | |
| Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
| Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
| Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
| MEM (10X), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmids | not commercially available | see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 |
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 |
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
References
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