我们描述了一种生成和扩增转基因呼吸道合胞病毒 (Rsv) 的方法和 Rsv 的优化斑块检测方法。我们通过创建两种重组病毒来说明这一协议, 它们分别允许对 RSV 复制进行定量, 并对 RSV 包涵体和包涵体相关颗粒动力学进行实时分析。
重组病毒的使用已成为基础或应用病毒学的关键。反向遗传学已被证明是一项极其强大的技术, 既可以破译病毒复制机制, 也可以研究抗病毒药物, 也可以为疫苗提供开发平台。然而, 为呼吸合胞病毒 (RSV) 等负链 RNA 病毒构建和操作反向遗传系统仍然很微妙, 需要特殊的专门知识。RSV 基因组是一种单链、负感 RNA, 约为 15 kb, 可作为病毒 RNA 复制和转录的模板。我们的反向遗传学系统使用人类 RSV 长株基因组 (HRSV) 的 cDNA 拷贝。这种 cDNA, 以及编码聚合酶复合物 (L、P、N 和 M2-1) 病毒蛋白的 Cdna, 被放置在 T7 聚合酶控制序列下的单个表达载体中。这些元素在 BSR-T展望5细胞中的转染, 稳定地表达 T7 聚合酶, 使重组 RSV 的细胞质复制和转录, 从而产生转基因病毒。一种新的 RSV, 存在于细胞表面和 bsrt75 的培养上清液中, 聚集在感染人 HEp-2 细胞进行病毒扩增。需要两轮或三轮扩增, 以获得含有 1 x10 6 至 1 x 10 7 斑块形成单元的病毒储存量。本文详细介绍了病毒库存的最佳收获、冷冻和滴定方法。我们通过创建两种分别表示游离绿色荧光蛋白 (RSV-GFP) 或病毒 M2-1 融合到 GFP (RSV-M1-GFP) 的重组病毒来说明本文所介绍的协议。我们展示了如何使用 RSV-GFP 量化 RSV 复制和 RSV-M1-GFP 可视化病毒结构, 以及病毒蛋白动态的活细胞, 通过视频显微镜技术。
人 RSV 是全世界婴儿急性呼吸道感染住院的主要原因1。此外, RSV 与成人的疾病负担相当, 与流感相当, 老年人的住院和死亡负担大多为2。目前还没有针对 rsv 的疫苗或特定的抗病毒药物, 但有希望的新药正在开发中 3,4。RSV 乘法定量技术的复杂性和繁重程度阻碍了寻找抗病毒药物或疫苗的工作, 尽管目前作出了相当大的努力。RSV 体外增殖的定量一般是基于费力、耗时、昂贵的方法, 主要是通过显微镜、免疫染色、斑块还原量、定量等方法对细胞病理效应进行分析。逆转录酶 (qRT)-聚合酶链反应 (PCR) 和酶联免疫吸附试验。具有修饰基因组和表示记者基因的病毒, 如 GFP 编码的病毒, 更适合于此类筛选。结合自动化平板阅读器的使用, 记者基因携带重组病毒可以使这些检测更适合标准化和高通量的目的。
RSV 是一种包覆的、非分段的负感 RNA 病毒, 属于肺炎家族的正交肺炎病毒属, 顺序mononegavirales5。RSV 基因组是一种单链、负感 RNA, 约为 15 kb, 它包含一个位于 3 ‘ 和 5 ‘ 末端的非编码区域, 称为 “引线” 和 “预告片”, 以及10个编码11蛋白的转录单元。基因顺序如下: 3 ‘-NS1、NS2、N、p、M、SH、g、f、M2 (m2-1 和 M2-2 蛋白编码) 和 L-5 ‘。基因组 RNA 由核蛋白 N 紧密包装, 以包塞化基因组 RNA 为模板, 病毒 rna 相关 RNA 聚合酶 (RdRp) 将确保病毒 RNA 的转录和复制。病毒 Rrp 由携带核苷酸聚合酶活性的大蛋白 L、其强制性辅因子磷蛋白 P 和作为病毒转录因子6的 m2-1 蛋白组成。在受感染的细胞中, RSV 诱导细胞质体内含物的形成, 称为包涵体 (IBs)。在几个mononegavirales7,8, 9,10中观察到了类似的形态类似的细胞质内含物。最近关于狂犬病毒、泡状口炎病毒 (vsv)、埃博拉病毒和 rsv 的研究表明, 病毒 rna 合成发生在 ibs 中, 因此可以被视为病毒工厂8,9,11,12. 病毒工厂集中了病毒 rna 合成所需的 rna 和病毒蛋白, 还含有细胞蛋白 13、14、15、16、17. ibs 表现出一个称为 IB-associated 颗粒 (iba) 的功能亚隔间, 该亚隔间集中了新合成的新生病毒 mrna 以及 mRNA 蛋白。在 Ibag 中没有检测到基因组 Rna 和 L、P 和 N。Ibag 是 IBs 内部的小动态球状结构, 表现为液体细胞器12的性质。尽管 IBs 在病毒增殖中发挥着核心作用, 但对这些病毒工厂的性质、内部结构、形成和运营了解甚少。
来自 cDNA 的脊髓灰质炎病毒基因组的表达使 1981年18年首次感染病毒克隆得以产生.对于单链阴性 RNA 病毒, 直到1994年才产生第一种狂犬病病毒, 然后将质粒转染成细胞19 。1995年20年公布了第一个基于血浆的 rsv 反向遗传系统.反向遗传学在病毒学领域取得了重大进展。在病毒基因组中引入特定修饰的可能性为 RNA 病毒的复制和发病机制提供了重要的见解。这项技术还通过有针对性的一系列修改, 使疫苗的开发能够产生具体的衰减。基因组修饰允许快速定量的病毒增殖大大改善了抗病毒筛选和研究其作用模式。
虽然前面描述过, 但获得转基因 Rsv 仍然很微妙。在这里, 我们详细介绍了一种创建两种类型的重组 HRSV 的协议, 分别表示 RSV-GFP 或 RSV-M1-GFP。在该协议中, 我们描述了抢救新的重组病毒所需的转染条件, 以及它们的扩增, 以获得高滴度的病毒库存, 适合可重复的实验。这里没有描述反向遗传学载体本身的构造。我们确实描述了最佳收集和冷冻病毒种群的方法。量化病毒感染颗粒最准确的方法仍然是斑块检测。细胞感染了连续稀释的分析悬浮液和孵育覆盖, 禁止扩散自由病毒颗粒在上清液。在这种情况下, 病毒只会感染连续的细胞, 形成每个初始传染性颗粒的 “斑块”。在传统的 RSV 滴定法中, 斑块通过免疫染色结果, 并在显微观察下计数。这种方法既昂贵又耗时。在这里, 我们描述了一个非常简单的协议 RSV 斑块检测使用微晶纤维素覆盖, 使斑块的形成可见肉眼。我们展示了如何使用 RSV-GFP 来测量 RSV 复制, 从而量化抗病毒药物的影响。结合反向遗传学和活体成像技术, 我们展示了 RSV-M1-GFP 如何允许科学家在活细胞中想象 M2-1, 并跟踪细胞内病毒结构的动态, 如 IBs。
本文提出了一种从五种质粒中抢救重组 Rsv 并对其进行扩增的方法。操纵病毒基因组的能力使病毒学研究彻底改变了实验突变, 并表达了一个额外的基因或标记的病毒蛋白。我们在本文中描述并使用的 RSV 是一种病毒, 表达了记者基因, RSV-GFP (未出版), 并表达了一个 M2-1 蛋白融合到 GFP 标签12。RSV 救援具有挑战性, 需要练习。转染效率至关重要, 这取决于转染试剂的明智选择和转染协…
The authors have nothing to disclose.
作者感谢来自美国马萨诸塞州波士顿 & 波士顿的秦宇博士提供了 AZD4316 药物。作者感谢 Cymages 平台, 以便访问 Scnr 奥林巴斯显微镜, 该显微镜得到了法兰西岛 (DIM one 健康) 地区的资助。作者感谢 INSERM 和凡尔赛圣昆廷大学的支持。
35mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
BSRT7/5 | not commercially available | See ref 22. Buchholz et al, 1999 | |
Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
MEM (10X), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
Plasmids | not commercially available | see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014 | |
See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 |
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 |
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |