Summary

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Published: April 04, 2019
doi:

Summary

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Abstract

Het gebruik van recombinante virussen is in basic of toegepaste Virologie van cruciaal belang geworden. Omgekeerde genetica heeft bewezen een uiterst krachtige technologie, zowel ontcijferen van virale replicatie mechanismen te bestuderen van antivirale middelen of ontwikkelplatform voor vaccins. De bouw en de manipulatie van een omgekeerde genetische systeem voor een negatieve-streng RNA-virus zoals een respiratoir syncytieel virus (RSV), echter blijft gevoelige en speciale kennis vereist. Het RSV genoom is een single-strand, negatief-sense RNA van ongeveer 15 kb dat als een sjabloon voor zowel virale RNA replicatie en transcriptie fungeert. Onze omgekeerde genetica-systeem gebruikt een cDNA kopie van het menselijk genoom van de RSV lange stam (HRSV). Dit cDNA, evenals de cDNAs virale eiwitten van de polymerase van complexe codering (L, P, N en M2-1), worden in afzonderlijke expressievectoren onder T7 polymerase besturingsprocessen geplaatst. De transfectie van deze elementen in de BSR-T7/5 cellen, die stabiel express T7 polymerase, kan men cytoplasmatische replicatie en transcriptie van de recombinante RSV, die aanleiding geven tot genetisch gemodificeerde virionen. Een nieuwe RSV, die aanwezig is op het celoppervlak en in het supernatant van cultuur van BSRT7/5, wordt verzameld om te infecteren menselijke HEp-2 cellen voor virale versterking. Twee of drie rondes van versterking nodig zijn om te verkrijgen van virale bouillon met 1 x 10,6 tot en met 1 x 107 plaque-vormende eenheden (PFU) / mL. Methoden voor de optimale oogsten, bevriezing en titratie van virale voorraden worden hier in detail beschreven. We illustreren het protocol hier gepresenteerd door het creëren van twee recombinante virussen respectievelijk uiten gratis groen fluorescente proteïne (GFP) (RSV-GFP) of virale M2-1 gesmolten tot GFP (RSV-M2-1-GFP). We laten zien hoe met RSV-GFP kwantificeren RSV replicatie en de RSV-M2-1-GFP te visualiseren van virale structuren, evenals de dynamiek van de virale eiwitten in levende cellen, met behulp van video microscopie technieken.

Introduction

Menselijke RSV is de belangrijkste oorzaak van hospitalisatie voor acute respiratoire landstreekbesmetting in zuigelingen wereldwijd1. RSV is bovendien gekoppeld aan een aanzienlijke ziektelast in volwassenen vergelijkbaar met influenza, met de meeste van de hospitalisatie en sterfte last in de oudere2. Er zijn geen vaccins of specifieke antivirale middelen beschikbaar nog tegen RSV, maar veelbelovende nieuwe drugs zijn in ontwikkeling3,4. De complexiteit en de zwaarte van de technieken van kwantificering van RSV vermenigvuldiging belemmeren de zoekt antivirale middelen of vaccins ondanks huidige aanzienlijke inspanningen. De kwantificering van RSV vermenigvuldiging in vitro is over het algemeen gebaseerd op omslachtige, tijdrovende en dure methoden, die meestal in de analyse van de cytopathogeen effect door microscopie, immunokleuring, vermindering van de plaque testen, kwantitatieve bestaat reverse-transcriptase (qRT)-de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en enzyme-linked immunosorbent assay proeven. Virussen met gemodificeerde genoom en het uiten van reporter genen, zoals codering voor de GFP, zijn meer geschikt voor dergelijke vertoningen. Gekoppeld aan het gebruik van geautomatiseerde plaat lezers, kunnen reporter gene-uitvoering recombinante virussen maken deze testen meer geschikt voor normalisatie en hoog-productie doeleinden.

RSV is een omhuld, nonsegmented negatief-sense RNA-virus dat tot het geslacht van de Orthopneumovirus van de Pneumoviridae familie, orde Mononegavirales5 behoort. Het RSV genoom is een single-strand, negatief-sense RNA van ongeveer 15 kb, waarin een noncoding regio op de 3′ en 5′ extremiteiten leider en Trailer en 10 transcriptionele eenheden codering 11 eiwitten. De genen worden als volgt gerangschikt: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codering voor M2-1 en M2-2 eiwitten) en L-5′. De genomische RNA is strak verpakt door de nucleoproteïne N. Using encapsidated genomic RNA als een sjabloon, virale RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp) zal zorgen voor transcriptie en replicatie van de virale RNA. Virale RdRp bestaat uit het grote eiwit L die per se de polymeraseactiviteit nucleotide draagt, zijn verplichte cofactor de phosphoprotein P en de M2-1 proteïne die als een virale transcriptie functioneert factor6. In de geïnfecteerde cellen induceert RSV de vorming van cytoplasmatische insluitingen opneming instanties (IBs) genaamd. Morfologisch soortgelijke cytoplasmatische insluitingen zijn waargenomen voor diverse Mononegavirales7,8,9,10. Recente studies over rabiësvirus, vesiculaire stomatitis virus (VSV), Ebola-virus en RSV bleek dat virale RNA-synthese treedt op in IBs, dat kunnen dus worden beschouwd als virale fabrieken8,9,11, 12. de virus fabrieken concentreren de RNA en virale eiwitten nodig is voor virale RNA-synthese en bevatten ook cellulaire eiwitten13,14,15,16, 17. IBs vertonen een functionele subcompartment genaamd IB-geassocieerde korrels (IBAGs), die zich concentreren het nieuw synthetized ontluikende virale mRNA samen met de M2-1 proteïne. De genomische RNA en de L, P en N worden niet gedetecteerd in IBAGs. IBAGs zijn kleine dynamische bolvormige structuren binnen IBs die de eigenschappen van vloeibare organellen12vertonen. Ondanks de centrale rol van IBs in virale vermenigvuldiging, is zeer weinig bekend over de aard, de interne structuur, de vorming en de werking van deze virale fabrieken.

De expressie van het genoom van een poliovirus uit een cDNA ingeschakeld de productie van de eerste besmettelijke virale kloon in 198118. Voor single-stranded negatieve RNA virussen was het niet tot 1994 dat de productie van een eerste rabiësvirus na transfectie van plasmiden in cellen19 plaatsvond. Het eerste plasmide gebaseerde omgekeerde genetische systeem voor RSV werd gepubliceerd in 199520. Omgekeerde genetica hebben geleid tot belangrijke ontwikkelingen op het gebied van virologie. Kritisch inzicht in de replicatie en pathogenese van RNA-virussen heeft voorzien in de mogelijkheid van de invoering van specifieke wijzigingen in het virale genoom. Deze technologie heeft de ontwikkeling van vaccins ook aanzienlijk vergemakkelijkt doordat specifieke demping door middel van gerichte reeks wijzigingen. Genoom wijzigingen waardoor een snelle kwantificering van virale vermenigvuldiging sterk verbeterd de antivirale screening en de studie van hun werkingsmechanisme.

Hoewel eerder beschreven, blijft verkrijgen van genetisch gemodificeerde RSVs gevoelig. Hier, detail we een protocol bij het maken van twee soorten recombinante HRSV, respectievelijk uiting van RSV-GFP of RSV-M2-1-GFP. In dit protocol beschrijven we de voorwaarden van de transfectie moest redden de nieuwe recombinante virussen, evenals hun versterking te verkrijgen van virale voorraden met hoge titer, geschikt voor reproduceerbare experimenten. De bouw van het reverse genetics vectoren wordt per se hier niet beschreven. We worden methoden beschreven voor de optimale oogsten en invriezen van virale voorraden. De meest nauwkeurige methode te kwantificeren virale besmettelijke deeltjes blijft plaque assay. Cellen zijn besmet met seriële verdunningen van de geanalyseerde schorsing en geïncubeerd met een overlay die de verspreiding van gratis virale deeltjes in het supernatant verbiedt. In dergelijke omstandigheden, zal het virus alleen aangrenzende cellen vormen een “plaque” voor elk initiële infectieuze deeltje infecteren. In de conventionele RSV titratie assay, zijn plaques geopenbaard door immunokleuring en geteld onder microscopische observatie. Deze methode is duurder en tijdrovender. We beschreven hier een heel simpel protocol voor een RSV plaque assay met microkristallijne cellulose overlay waarmee de vorming van plaques zichtbaar met het blote oog. We laten zien hoe RSV-GFP kan worden gebruikt op maatregel RSV replicatie en, dus, op het kwantificeren van de impact van antivirale middelen. Omgekeerde genetica en levende imaging technologie te combineren, we laten zien hoe de RSV-M2-1-GFP wetenschappers te visualiseren M2-1 in levende cellen en volgen de dynamiek van intracellulaire virale structuren, zoals IBs toestaat.

Protocol

1. materiële voorbereiding Cel media kopen (verminderde serum media, minimale essentiële media [MEM], 10 x MEM en Dulbecco gewijzigd van Eagle’s medium [DMEM]), transfectiereagens en microkristallijne cellulose (Zie Tabel van materialen). Verkrijgen van de volgende vectoren voor omgekeerde genetica: de genomische vector(s) en de codering van de N-eiwitten en de complexe eiwitten van polymerase expressievectoren. De genomische vectoren bevatten het volledige cDNA genoom van RSV-GFP (…

Representative Results

In dit werk beschreven we een gedetailleerd protocol voor de productie van recombinante virussen van RSV uiting van een fluorescente proteïne (Figuur 2). In pRSV-GFP, is het GFP-gen tussen de P en M genen, geïntroduceerd als beschreven voor het Cherry gen in eerder gepubliceerde werk21. In de pRSV-M2-1-GFP, de M2 gene was links onaangeroerd en een extra gen dat codeert voor M2-1-GFP werd ingevoegd tussen SH en G genen<sup class="xref…

Discussion

Hier presenteren we een methode van redding van recombinant RSVs van vijf plasmiden en hun versterking. De mogelijkheid om het manipuleren van het genoom van virussen heeft een revolutie teweeggebracht in virologie onderzoek om te testen van mutaties en express een extra gen of een tagged virale eiwitten. Het RSV hebben we beschreven en gebruikt als een voorbeeld in dit artikel een uiting van een verslaggever-gen, de RSV-GFP is (ongepubliceerd), en spreekt een M2-1 eiwit tot een GFP label12 gesmolten</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Dr. Qin Yu van AstraZeneca R & D Boston, MA, USA, voor het verstrekken van de drug AZD4316. De auteurs zijn dankbaar aan het Cymages platform voor toegang tot de ScanR Olympus Microscoop, die werd ondersteund door subsidies uit de regio Ile-de-France (DIM Eén gezondheid). De auteurs erkennen steun van het INSERM en de Universiteit van Versailles Saint-Quentin.

Materials

35mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See ref 22. Buchholz et al, 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10X), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5′ proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -. A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus – direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5′-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).

Play Video

Cite This Article
Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J., Gault, E., Rameix-Welti, M. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).

View Video