جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي
Summary
يصف لنا طريقة لتوليد وتضخيم وراثيا تعديل فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي (رسفس) ومقايسة البلاك أمثل رسفس. يمكننا توضيح هذا البروتوكول عن طريق إنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي تسمح بالتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV ويعيش تحليل RSV إدراج الهيئات وديناميات حبيبات إدراج الهيئات المرتبطة.
Abstract
استخدام فيروسات المؤتلف أصبح عاملاً حاسما في علم الفيروسات الأساسية أو التطبيقية. وقد ثبت علم الوراثة العكسي لتكون عبارة عن تقنية قوية للغاية، سواء لفك آليات النسخ المتماثل الفيروسية أو لدراسة الأدوية المضادة للفيروسات أو توفير منصة تطوير اللقاحات. البناء والتلاعب بنظام الجينية العكسية لسلبية-حبلا فيروسات الرنا مثل فيروس المخلوي تنفسي (RSV)، ومع ذلك، تظل حساسة ويتطلب دراية خاصة. هو الجينوم RSV رنا طاق واحد، والشعور السلبي من حوالي 15 كيلوبايت، يعمل كقالب للنسخ المتماثل للجيش الملكي النيبالي الفيروسية والنسخ. لدينا نظام الوراثة عكس يستخدم نسخة كدنا RSV سلالة طويلة المجين البشري (هرسف). يتم وضع هذا كدنا، فضلا عن كدناس ترميز البروتينات الفيروسية من بوليميريز المعقدة (ل، ف، ن، و M2-1)، في ناقلات التعبير الفردي تحت T7 بوليميريز تسلسلات تحكم. تعداء هذه العناصر في زنزانات فرقة البحث-T7/5، التي تعبر عن ستابلي T7 بوليميريز، يسمح بالنسخ المتماثل هيولى والنسخ من RSV المؤتلف، مما أدى إلى فيريونس المعدلة وراثيا. وتجمع RSV جديدة، التي موجودة على سطح الخلية وفي المادة طافية الثقافة BSRT7/5، لتصيب الإنسان HEp-2 الخلايا للتضخيم الفيروسية. اثنين أو ثلاث جولات من التضخيم مطلوبة للحصول على الأرصدة الفيروسي الذي يحتوي على 1 × 106 و 1 × 107 اللوحة تشكيل وحدات (بفو)/مل. أساليب للأمثل الحصاد، وتجميد، ومعايرة الأرصدة الفيروسية موضحة هنا بالتفصيل. نحن توضيح البروتوكول المعروضة هنا بإنشاء اثنين من الفيروسات المؤتلف على التوالي التعبير عن البروتين الفلورية الخضراء الحرة (بروتينات فلورية خضراء) (RSV-التجارة والنقل) أو الفيروسي M2-1 حشو للتجارة والنقل (RSV-M2-1-التجارة والنقل). ونحن تبين كيفية استخدام RSV-التجارة والنقل للتحديد الكمي للنسخ المتماثل RSV و RSV-M2-1-التجارة والنقل لتصور الهياكل الفيروسية، فضلا عن ديناميات الفيروسية البروتين في الخلايا الحية، باستخدام تقنيات الفحص المجهري الفيديو.
Introduction
RSV البشرية هو السبب الرئيسي لدخول المستشفى لعدوى الجهاز التنفسي الحادة في الأطفال الرضع في جميع أنحاء العالم1. وبالإضافة إلى ذلك، يرتبط RSV عبء مرض كبيرة في البالغين مماثلة للأنفلونزا، مع معظم المستشفيات وعبء وفيات المسنين2. لا تتوفر أي اللقاحات أو الأدوية المضادة للفيروسات محددة حتى الآن ضد RSV، لكن الواعدة عقاقير جديدة في التنمية3،4. التعقيد والخفة لتقنيات القياس الكمي للضرب RSV تعرقل البحث عن الأدوية المضادة للفيروسات أو اللقاحات على الرغم من الجهود الكبيرة الحالية. ويستند التقدير الكمي للضرب RSV في المختبر عموما على طرق شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة، التي تتكون غالباً في تحليل تأثير سيتوباثيك بالفحص المجهري، إيمونوستينينج، والحد من البلاك فحوصات، الكمية عكس المنتسخة (قرة)-تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والمرتبط بالانزيم الممتز الاعتداء الاختبارات. الفيروسات مع مورثات معدلة والتعبير عن الجينات مراسل، مثل تلك الترميز للتجارة والنقل، وهي أكثر ملاءمة لمثل هذه العروض. بالإضافة إلى استخدام لوحة الآلي القراء، مراسل الجينات تحمل فيروسات المؤتلف يمكن جعل هذه فحوصات أكثر ملاءمة لأغراض التوحيد والفائق.
هو RSV المغلفة، نونسيجمينتيد فيروس الحمض النووي الريبي الشعور السلبي الذي ينتمي إلى جنس أورثوبنيوموفيروس بنيوموفيريداي العائلية، ترتيب مونونيجافيراليس5. هو الجينوم RSV رنا طاق واحد، والشعور السلبي لحوالي 15 كيلو بايت, التي تحتوي على منطقة فضله في الأطراف 3 ‘و 5’ ودعا الزعيم ومقطورة و 10 وحدات النسخي ترميز البروتينات 11. يتم ترتيب الجينات على النحو التالي: 3 ‘-NS1, NS2، ن، ف، م، ش، ز، و، M2 (ترميز للبروتينات M2-1 و M2-2) و L-5’. الجيش الملكي النيبالي الجينوم محكم وتعبئتها بالبروتين النووي أ. استخدام الجيش الملكي النيبالي المجينية انكابسيداتيد كقالب، وتعتمد على الجيش الملكي النيبالي الفيروسية بوليميريز الحمض النووي الريبي (RdRp) سيضمن النسخ والنسخ المتماثل من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية. RdRp الفيروسية وتتألف من البروتين الكبيرة ل الذي يحمل النشاط بوليميراز النوكليوتيدات في حد ذاتها، عامل مساعد إلزامية فوسفوبروتين ف والبروتين M2-1 الذي يعمل كنسخ فيروسية6. في الخلايا المصابة، يستحث RSV تشكيل تضمينات هيولى دعا الهيئات إدراج (IBs). وقد لوحظت تضمينات هيولى شكلياً مشابهة ل عدة مونونيجافيراليس7،،،من89،10. الدراسات التي أجريت مؤخرا على فيروس داء الكلب، فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة) وفيروس إيبولا و RSV أظهرت أن توليف الحمض النووي الريبي الفيروسية تحدث في الرابطة، التي يمكن اعتبارها المصانع الفيروسية8،،من911، وهكذا 12-يركز الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات الفيروسية المطلوبة لتوليف الحمض النووي الريبي الفيروسية المصانع الفيروس وتحتوي أيضا على البروتينات الخلوية13،،من1415،16، 17. IBs معرض سوبكومبارتمينت وظيفية تسمى حبيبات المرتبطة IB (إيباجس)، التي تركز سينثيتيزيد حديثا مرناً الفيروسية الوليدة جنبا إلى جنب مع البروتين M2-1. لا يتم كشف الجيش الملكي النيبالي الجينوم ول، ف ون في إيباجس. إيباجس هي هياكل كروية الحيوي صغيرة داخل الرابطة الذي يحمل خصائص السائل العضيات12. وعلى الرغم من الدور المركزي للرابطة في تكاثر الفيروس، المعروف القليل جداً حول طبيعة وهيكل داخلي، وتشكيل، وتشغيل هذه المصانع الفيروسية.
التعبير عن جينوم فيروس شلل الأطفال من كدنا مكن إنتاج استنساخ الفيروسية المعدية الأولى في عام 198118. للبحث عن فيروسات الحمض النووي الريبي السلبية واحد-الذين تقطعت بهم السبل، لم يكن حتى عام 1994 أن إنتاج أول فيروس داء الكلب عقب تعداء البلازميدات إلى خلايا19 وقع. وصدر أول بلازميد عكس الوراثية النظام القائم ل RSV في 199520. علم الوراثة العكسي أدت إلى إحراز تقدم كبير في مجال علم الفيروسات. إمكانية إدخال تعديلات محددة في الجينوم الفيروسي قدمت رؤى الحرجة في النسخ المتماثل والمرضية من فيروسات الرنا. ويسرت هذه التكنولوجيا أيضا إلى حد كبير تطوير لقاحات بالسماح التوهين محددة من خلال مجموعة مستهدفة من التعديلات. التعديلات الجينوم مما يتيح إجراء تقييم كمي سريع لتكاثر الفيروس إلى حد كبير تحسين فحص الأدوية المضادة للفيروسات، ودراسة لطريقة العمل.
على الرغم من أن وصف سابقا، يبقى الحصول على رسفس المعدلة وراثيا حساسة. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء نوعين من هرسف المؤتلف، على التوالي يعبر عن RSV-التجارة والنقل أو RSV-M2-1-التجارة والنقل. في هذا البروتوكول، يصف لنا تعداء الظروف اللازمة لإنقاذ الفيروسات التوليفية الجديدة، فضلا عن التضخيم بالحصول على الأرصدة الفيروسية مع ارتفاع عيار، مناسبة للتجريب استنساخه. بناء ناقلات الوراثة عكس في حد ذاتها لا يرد هنا. يصف لنا أساليب الحصاد المثلى وتجميد الأرصدة الفيروسية. الطريقة الأكثر دقة لقياس الجسيمات الفيروسية المعدية يظل البلاك المقايسة. الخلايا المصابة بتخفيف المسلسل من تعليق تم تحليلها والمحتضنة مع تراكب التي تحظر نشر الجزيئات الفيروسية الحرة في المادة طافية. في مثل هذه الظروف، سيكون فقط تصيب الفيروس الخلايا المتجاورة تشكل “لوحة” لكل الجسيمات المعدية الأولى. في مقايسة المعايرة RSV التقليدية، كشفت عنها immunostaining لويحات وتحسب تحت الملاحظة المجهرية. هذا الأسلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا يمكننا وصف بروتوكول بسيط جداً مقايسة البلاك RSV استخدام تراكب ميكروكريستالاين سيليولوز التي تمكن من تشكيل لويحات مرئية بالعين المجردة. علينا إظهار كيف يمكن استخدام RSV-التجارة والنقل لتدبير RSV النسخ المتماثل، ومن ثم لقياس تأثير الأدوية المضادة للفيروسات. الجمع بين علم الوراثة العكسي وتكنولوجيا التصوير الحي، وعلينا أن نبرهن كيف يسمح RSV-M2-1-بروتينات فلورية خضراء العلماء إلى تصور م 2-1 في الخلايا الحية واتباع القوى المحركة لهياكل الفيروسي داخل الخلية، مثل الرابطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم طريقة لإنقاذ المؤتلف رسفس من البلازميدات الخمسة، وعلى التضخيم. القدرة على التلاعب جينوم الفيروسات أحدث ثورة في بحوث علم الفيروسات لاختبار الطفرات والتعبير عن جينات إضافية أو بروتين فيروسي المعلمة. RSV لدينا وصف والمستخدمة كمثال في هذا المقال هو فيروس التعبير عن جين مراسل، RSV-بروت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور تشين يو من استرا زينيكا R & D بوسطن، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية، لتوفير الدواء AZD4316. الكتاب ممتنون لمنصة سيماجيس للوصول إلى المجهر أوليمبوس ScanR، الذي كان يدعمه المنح المقدمة من المنطقة القارسة (الصحة واحد خافت). الكتاب الاعتراف بدعم من INSERM وجامعة فرساي ساينتكوينتين.
Materials
| 35mm µ dish for live cell imaging | Ibidi | 81156 | |
| A549 | ATCC | ATCC CCL-185 | |
| Avicel RC-591 | FMC BioPolymer | Avicel RC-591 | Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent. |
| BSRT7/5 | not commercially available | See ref 22. Buchholz et al, 1999 | |
| Crystal violet solution | Sigma | HT90132 | |
| Fluorescence microscope for observations | Olympus | IX73 Olympus microscope | |
| Fluorescence microscope for videomicroscopy | Olympus | ScanR Olympus microscope | |
| HEp-2 | ATCC | ATCC CCL-23 | |
| HEPES ≥99.5% | Sigma | H3375 | |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent. |
| MEM (10X), no glutamine | ThermoFisher Scientific | 11430030 | |
| MEM, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 41090-028 | |
| MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% | Sigma | M7506 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 51985-026 | |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Plasmids | not commercially available | see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014 | |
| See Saw Rocker | VWR | 444-0341 | |
| Si RNA GAPDH | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05 |
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. |
| Si RNA IMPDH2 | Dharmacon | ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005 |
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG; |
| Si RNA RSV N | Dharmacon | ON-TARGETplus custom siRNA | UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA |
| SiRNA NT | Dharmacon | ON-TARGETplus Non-targeting Pool | |
| SiRNA transfection reagent | Dharmacon | DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 | Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent. |
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Spectrofluorometer | Tecan | Tecan infinite M200PRO |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
- DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
- DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
- Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
- Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
- Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
- Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
- Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
- Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
- Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
- Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
- Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
- Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
- Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
- Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
- Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
- Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
- Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5′ proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
- Rameix-Welti, M. -. A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
- Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
- Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
- McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus – direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
- Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
- Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5′-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
- Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
- Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
- Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
- Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
- DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
- Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
- Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).
