Summary

Génération, Amplification et titrage du virus Syncytial respiratoires recombinants

Published: April 04, 2019
doi:

Summary

Nous décrivons une méthode permettant de générer et amplifier les organismes génétiquement modifiés virus syncytiales respiratoires (RSVs) et un dosage de plaque optimisé pour RSVs. Nous illustrons ce protocole en créant deux virus recombinants qui sont respectivement permettent la quantification de la réplication de la RSV et analyse des corps d’inclusion de RSV et dynamiques associés à corps d’inclusion des granules en direct.

Abstract

L’utilisation de virus recombinants est devenu cruciale en virologie fondamentale ou appliquée. Génétique inverse s’est avérée pour être une technologie extrêmement puissante, tant pour décrypter les mécanismes de réplication virale et à étudier les antiviraux ou fournir la plate-forme de développement pour les vaccins. La construction et la manipulation d’un système génétique inverse pour un négatif-strand RNA virus comme un virus respiratoire syncytial (VRS), cependant, reste délicates et nécessite des savoir-faire spécial. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko qui sert de matrice pour viral replication RNA et transcription. Notre système de génétique inverse utilise une copie de cDNA du génome humain RSV souche longue (HRSV). Cet ADNc, mais aussi des CDNA codant pour des protéines virales de la polymérase complexe (L, P, N et M2-1), est placés dans des vecteurs d’expression individuelle en vertu de séquences de contrôle polymérase T7. La transfection de ces éléments dans les cellules de BSR-T7/5, qui expriment le stablement polymérase T7, permet la réplication cytoplasmique et la transcription de la RSV recombinante, donnant lieu à des virions génétiquement modifiées. Une nouvelle RSV, qui est présent à la surface cellulaire et dans le surnageant de culture de BSRT7/5, est recueillie pour infecter des cellules humaines de HEp-2 pour l’amplification virale. Deux ou trois rondes d’amplification sont nécessaires pour obtenir des stocks viraux contenant 1 x 106 à 1 x 107 unités de formation de plaques (PFU) / mL. Méthodes d’optimal de récolte, gel et titrage des stocks viraux sont décrites ici en détail. Nous illustrons le protocole présenté ici en créant deux virus recombinants exprimant respectivement gratuit protéine fluorescente verte (GFP) (RSV-GFP) ou virale M2-1 fusionnée à la GFP (RSV-M2-1-GFP). Nous montrons comment utiliser RSV-GFP pour quantifier la réplication RSV et la RSV-M2-1-GFP de visualiser les structures virales, ainsi que la dynamique de protéine virale dans des cellules vivantes, en utilisant des techniques de microscopie vidéo.

Introduction

VRS humaine est la principale cause d’hospitalisation chez les infections respiratoires aiguës dans les bébés dans le monde1. En outre, le VRS est associé à une morbidité importante dans comparable à la grippe, avec la plus grande partie de l’hospitalisation et la charge de mortalité dans les personnes âgées de2adultes. Il n’y aucun vaccins ou des antiviraux spécifiques disponibles encore contre RSV, mais promettant de nouveaux médicaments sont en développement3,4. La complexité et la lourdeur des techniques de quantification de la multiplication de la RSV font obstacle à la recherche d’antiviraux ou vaccins malgré des efforts considérables actuels. La quantification de la multiplication de RSV in vitro est généralement fondée sur des méthodes laborieux, longues et coûteux, qui consistent principalement en l’analyse de l’effet cytopathogène par microscopie, immunomarquage, réduction de la plaque essais, quantitatives la transcriptase inverse (EIR)-réaction en chaîne par polymérase (PCR) et les immuno-essais de dosage. Virus avec des génomes modifiés et exprimant des gènes rapporteurs, comme ceux codant pour la GFP, sont plus adaptés pour ces projections. Couplé à l’usage des lecteurs de plaques automatisé, virus recombinants porteurs de gène de journaliste peuvent faire ces dosages plus adapté à la normalisation et haut débit.

Le VRS est un virus à ARN sens négatif enveloppé, un qui appartient au genre Orthopneumovirus de la Pneumoviridae famille, ordre Mononegavirales5. Le génome de la RSV est un ARN monocaténaire, sens négatif d’environ 15 Ko, qui contient une région non codante aux extrémités 3′ et 5′ appelé Leader et remorque et 10 unités de transcriptionnelles codant des 11 protéines. Les gènes sont classés comme suit : 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (codant pour des protéines M2-1 et M2-2) et L-5′. L’ARN génomique est étroitement conditionné par la nucléoprotéine N. Using l’ARN génomique encapsidés comme gabarit, virale ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) assurera la transcription et la réplication de l’ARN viral. RdRp virale est composé de la protéine grande L qui porte l’activité polymérase de nucléotide en soi, son cofacteur obligatoire la phosphoprotéine de P et la protéine M2-1 qui fonctionne comme une transcription virale facteur6. Dans les cellules infectées, RSV induit la formation d’inclusions cytoplasmiques appelées inclusions (IBs). Les inclusions cytoplasmiques morphologiquement semblables ont été observées pour plusieurs Mononegavirales7,8,9,10. Études récentes sur le virus rabique, virus de la stomatite vésiculaire (VSV), virus Ebola et RSV a montré que la synthèse de l’ARN virale s’effectue en IBs, qui peuvent ainsi être considérés comme usines virales8,9,11, 12. les usines de virus concentré l’ARN et des protéines virales requis pour la synthèse de l’ARN virale et contiennent également des protéines cellulaires13,14,15,16, 17. IBs présentent un plus fonctionnel appelé IB associées aux granules (IBAGs), qui concentrent la nouvellement synthétisée ARNm viral naissant ainsi que de la protéine M2-1. L’ARN génomique et le L, P et N ne sont pas détectés dans IBAGs. IBAGs sont de petites structures sphériques dynamiques à l’intérieur de l’ISB qui présentent les propriétés des organites liquide12. Malgré le rôle central de l’IBs dans la multiplication virale, on sait peu sur la nature, structure interne, formation et exploitation de ces usines virales.

L’expression du génome d’un poliovirus chez un ADNc a permis la production du premier clone virale infectieuse en 1981,18. Pour négatifs virus à ARN simple brin, ce n’est qu’en 1994 que la production d’un premier virus de la rage après transfection des plasmides dans les cellules19 a eu lieu. La première axée sur le plasmide inverse système génétique pour RSV a été publié en 1995,20. Génétique inverse ont conduit à des avancées majeures dans le domaine de la virologie. La possibilité d’introduire des modifications spécifiques dans le génome viral a fourni un aperçu critique de la réplication et la pathogenèse des virus à ARN. Cette technologie a également grandement facilité le développement de vaccins en permettant atténuation spécifique ciblés série de modifications. Modifications du génome qui permet un dosage rapide de multiplication virale grandement amélioré le contrôle antiviral et étude de leur mode d’action.

Bien que décrite précédemment, obtention d’organismes génétiquement modifiés RSVs reste délicate. Ici, nous détaillons un protocole pour créer deux types de recombinaison HRSV, exprimant respectivement RSV-GFP ou RSV-M2-1-GFP. Dans ce protocole, nous décrivons les conditions de transfection nécessaires pour secourir les nouveaux virus recombinants, ainsi que leur amplification afin d’obtenir des stocks viraux avec un titre élevé, adapté aux expérimentations reproductibles. La construction des vecteurs de la génétique inverse en soi n’est pas décrit ici. Nous décrivent les méthodes de récolte optimale et gel des stocks viraux. La méthode la plus précise pour mesurer les particules infectieuses virales reste essai de plaque. Cellules sont infectées par des dilutions successives de la suspension analysée et incubées avec une surcouche qui interdit la diffusion de particules virales libres dans le surnageant. Dans de telles conditions, le virus infectera seulement des cellules contiguës formant une « plaque » pour chaque particule infectieuse initial. Dans l’essai de titrage de RSV classique, les plaques sont révélés par immunomarquage et comptés sous observation microscopique. Cette méthode est coûteuse et fastidieuse. Ici, nous avons décrit un protocole très simple pour un essai de plaque RSV à l’aide de superposition de cellulose microcristalline qui permet la formation de plaques visibles à le œil nu. Nous montrons comment RSV-GFP permet de mesure RSV réplication et, partant, de quantifier l’impact des antiviraux. La combinaison génétique inverse et technologie de l’imagerie live, nous démontrons comment RSV-M2-1-GFP permet aux chercheurs de visualiser M2-1 dans des cellules vivantes et de suivre la dynamique des structures virales intracellulaires, comme IBs.

Protocol

1. matérielle préparation Acheter des supports de la cellule (sérum réduit médias, minimales essentielles [MEM], 10 x MEM et Dulbecco de l’aigle modifié [DMEM]), réactif de transfection et cellulose microcristalline (voir Table des matières). Obtenir les vecteurs suivants de génétique inverse : la génomique vecteur (s) et les vecteurs d’expression codant pour la protéine N et les protéines complexe polymérase. Les vecteurs génomiques contiennent le génome complet …

Representative Results

Dans cet ouvrage, nous décrit un protocole détaillé pour produire des virus recombinants de RSV, exprimant une protéine fluorescente (Figure 2). Au pRSV-GFP, le gène de la GFP a été introduit entre les gènes P et M, comme pour le gène cerise en œuvre précédemment publiée21. Dans le pRSV-M2-1-GFP, le gène M2 a été laissé intact et un gène supplémentaire codant pour M2-1-GFP a été inséré entre SH et G gènes<sup cl…

Discussion

Nous présentons ici une méthode de sauvetage de recombinant RSVs de cinq plasmides et leur amplification. La possibilité de manipuler le génome du virus a révolutionné la recherche virologie afin de tester des mutations et exprimer un gène additionnel ou une protéine virale étiquetée. La RSV, nous avons décrit et utilisé comme un exemple de cet article est un virus exprimant un gène rapporteur, la RSV-GFP (inédit) et exprime une protéine M2-1 fusionnée à la GFP tag12. Sauvetage de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient m. Qin Yu de AstraZeneca R & D Boston, MA, é.-u., pour fournir le médicament AZD4316. Les auteurs sont reconnaissants à la plateforme Cymages pour l’accès au microscope ScanR Olympus, qui était soutenu par des subventions de la région Ile-de-France (DIM ONE HEALTH). Les auteurs reconnaissent le soutien de l’INSERM et l’Université de Versailles Saint-Quentin.

Materials

35mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See ref 22. Buchholz et al, 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10X), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05
SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005
SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO

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Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J., Gault, E., Rameix-Welti, M. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).

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