Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining
Summary
Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.
Abstract
Agrobacterium SP., es uno de los métodos más utilizados para obtener plantas transgénicas, ya que tiene la capacidad de transferir e integrar su propio T-ADN en genoma de la planta. Aquí, presentamos dos sistemas de transformación para modificar genéticamente las plantas de papa (Solanum tuberosum). En la transformación de a. tumefaciens , hojas están infectadas, las células transformadas se seleccionan y se regenera una planta transformada completa nueva con fitohormonas en 18 semanas. En la transformación de a. rhizogenes , tallos son infectados por las bacterias de la inyección con una aguja, las nuevas raíces peludas transformadas emergidas se detectan usando un marcador fluorescente rojo y se eliminan las raíces no-transformado. En 5-6 semanas, la planta resultante es un compuesto de una sesión de tipo salvaje con raíces peludas transformadas completamente desarrolladas. Para aumentar la biomasa, las raíces pilosas transformadas pueden ser suprimidas y uno mismo-propagar. Aplicamos ambos métodos de transformación de Agrobacterium –mediado para obtener las raíces que expresan el gen reportero GUS conducido por un promotor de genes biosintéticos de suberina. El procedimiento de tinción GUS se proporciona y permite la localización celular de la inducción del promotor. En ambos métodos, las raíces de papa transformada demostraron la coloración en el suberized de la endodermis y exodermis y además, en las raíces de a. rhizogenes transformó la actividad de GUS GUS también se detectó en el surgimiento de raíces laterales. Estos resultados sugieren que a. rhizogenes puede ser una herramienta rápida alternativa para estudiar los genes que se expresan en las raíces.
Introduction
Aparte de interés económico, la generación de plantas transgénicas tiene su propia importancia en la investigación para demostrar la función última de los genes y a comprender mejor la fisiología de las plantas y el desarrollo. El más utilizado método de inserción de ADN de la planta es Agrobacterium-mediado transformación. Agrobacterium tumefaciens es capaz de generar agallas de corona en el tejido infectado de muchas especies de plantas por la acción de su plásmido inductor de tumor de (Ti). El plásmido contiene una región de ADN de T con un conjunto de genes que se integrará en el genoma de la planta e inducir diferenciación de tejido1,2. El intercambio de estos genes dentro del ADN de T por el transgén ha permitido la generación de modificaciones de la planta específica evitando efectos fenotípicos3. Para facilitar el transgén de clonación en el T-ADN, la región T-DNA ha sido suprimida en un plásmido independiente llamado un plásmido binario, mientras que el resto de los genes del plásmido Ti (los genes de virulencia que permiten los mecanismos de transferencia y de inserción de T-DNA) han sido situado en un plásmido helper. Para la investigación de biotecnología vegetal, transformación por a. tumefaciens tiene varias ventajas: no necesita dispositivos costosos, es capaz de generar transformación de planta estable y transitoria y bajo número de gene copias están integradas en la cromosoma4. Sin embargo, para la mayoría de las plantas, pero no, de Arabidopsis la generación de los transformantes estables requiere regeneración de plantas de una sola o unas pocas células mediante fitohormonas exógenas, haciendo este proceso laborioso y desperdiciador de tiempo. A. rhizogenes es capaz de modificar el genoma de la planta, produciendo las raíces pilosas o raíces adventicias en los sitios de infección debido a la expresión de los genes rol (root locus) codificado en la inducción de raíz (Ri) plásmido5. Aunque menos estudiado que a. tumefaciens, a. rhizogenes también se utiliza para la obtención de raíces transgénicas. En este caso, el a. rhizogenes contiene el original T-ADN en el plásmido Ri y un plásmido binario con un segundo T-DNA llevando el transgén. Cuando el sitio de infección en tallo o hipocotilos, una planta compuesta se puede obtener, con nuevas raíces transgénicas peludas surgen brotes de tipo salvaje. Alternativamente, peludas raíces transformadas pueden desarrollarse autónomamente en vitro en los medios de comunicación con las entradas de fuente de carbono. El uso de a. rhizogenes en lugar de a. tumefaciens a producir tejido transgénico está ganando relevancia cuando la raíz es el órgano Diana, porque no es necesaria la regeneración de plantas y por lo tanto es más rápido y menos costoso. Estudios anteriores han demostrado que esta metodología apropiada para la caracterización fenotípica de raíz genes específicos6,7,8,9.
La papa (Solanum tuberosum) es el cuarto más importante cultivo en el mundo según la organización para la agricultura de las Naciones Unidas (FAO) y la alimentación ya que el tubérculo tiene importancia nutricional para el consumo humano por ser una buena fuente de vitaminas y minerales. Por eso, Papa se ha colocado en el foco de la biotecnología agrícola y también se considera como un buen modelo biológico genético y desarrollo de estudios de10,11. Transformación de la papa contribuyó significativamente a la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes los tejidos suberized a través de la caracterización de los genes implicados en suberina y cera biosíntesis12,13,14 ,15,16,17, monómero del suberin transporte Reglamento18 y transcripción19. El gen de la transferasa suberin feruloyl, FHT, es uno de estos genes biosintéticos caracterizados; su regulación a la baja da lugar a un fuerte deterioro de la protección de la peridermis, que se correlaciona con una disminución fuerte en ferulate ésteres de suberina y ceras en tubérculos de patata14. Concomitante, en raíces y semillas de Arabidopsis, el nocaut de su supuesta orthologue (ASFT/RWP1) también demostró su papel en la producción de ferulates Alquilo en suberina20,21. En Papa, la línea de reportero transcripcional FHT y el anticuerpo FHT demostraron respectivamente que se encuentran en la exodermis, endodermis, phellogen-derivados y en los tejidos heridos15la actividad del promotor y la proteína.
En este trabajo, detallamos un protocolo usando a. rhizogenes para producir transgénicas raíces peludas que se mantienen en una sesión de tipo salvaje, compuesto patata plantas generadoras o suprimido para crecer autónomamente en vitro. También ofrecemos el protocolo utilizando a. tumefaciens para obtener plantas de papa transgénicas completa. Como caso de estudio, a. rhizogenes y a. tumefaciens transformado con el mismo vector binario se utilizan para obtener las raíces con el promotor FHT conducción expresión de gen reportero GUS . Los resultados son registrados y comparados.
Protocol
Representative Results
Discussion
En Papa, el sistema más común para obtener plantas transgénicas completas estables utiliza la transformación por cepas de Agrobacterium tumefaciens que requieren organogénesis con fitohormonas exógenas. Aunque los protocolos de Agrobacterium base tiene el potencial para integrar el vector T-DNA secuencia25, esta metodología es aún más fácil y menos costoso para transformar plantas de patata. Durante los últimos años, el interés en a. rhizogenes-transformaci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, beca FPI para PB), el Ministerio de Economía y Competitividad, FEDER fondos (36725 AGL2012, AGL2015-67495-C2-1-R) y la Universidad de Girona (beca de doctorado a SF y grant SING11/1). Los autores agradecemos al Dr. Inge Broer (Instituto para el uso de la tierra, Universidad de Rostock, Rostock, Alemania) y Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, España) a. rhizogenes y la cepa de a. tumefaciens , respectivamente y el Dr. Marçal Soler y el Dr. Anna Plasencia por la ayuda y el apoyo recibido en la iniciación de los experimentos de transformación de a. rhizogenes (Universidad Toulouse III Paul Sabatier, CNRS, laboratorio de investigación de planta (LRSV), Castanet Tolosan, Francia). Los autores agradecen a Sara Gómez (Departamento de biología, UdG, Girona) por su valiosa asistencia en la realización del trabajo de laboratorio y cuidar de las plantas y Ferran Fontdecaba y Carla Sánchez quien ayudó con algunos de los experimentos mientras que estaban haciendo sus proyectos final de carrera.
Materials
|
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
|
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
|
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
|
Microscope |
Olympus |
||
|
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
|
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
|
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
|
pHmetre |
Crison |
||
|
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
|
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
|
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
|
Vacuum |
Dinko |
||
|
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
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