Здесь мы представляем два протокола для преобразования растений картофеля. Agrobacterium tumefaciens преобразование приводит к полной трансгенных растений в то время как Agrobacterium rhizogenes производит трансгенных волосатые корни в стрелять дикого типа, который может быть самостоятельной распространенный. Мы затем обнаружить промоутер активность GUS пятнать в преобразованной корни.
Agrobacterium sp. является одним из наиболее широко используемых методов для получения трансгенных растений, поскольку он имеет возможность передачи и интегрировать свой собственный T-ДНК генома растений. Здесь мы представляем два преобразования систем генетически изменить растений картофеля (Solanum tuberosum). В A. tumefaciens трансформации зараженные листья, трансформированных клеток выбираются и новый полный преобразованные завод генерируется с использованием фитогормонов в 18 недель. A. rhizogenes трансформации стебли зараженных инъекционных бактерии с помощью иглы, новых появившихся преобразованные волосатые корни обнаруживаются с помощью маркера красных флуоресцентных и корни-трансформированных удаляются. В 5-6 недель результатом завод представляет собой совокупность дикого типа стрелять с полностью развитой преобразованные волосатые корнями. Для увеличения биомассы, преобразованные волосатые корни можно подакцизным и распространяются самостоятельно. Мы применяли оба методы трансформации Agrobacterium –опосредованной получить корни, выражая GUS Репортер ген обусловлен промоутера суберин биосинтетических генов. GUS пятная процедуру предоставляется и позволяет ячейки локализации промоутер индукции. В обоих методах корни преобразованные картофеля показал, что окрашивание в suberized эндодермы и exodermis и Кроме того, а. rhizogenes преобразован корни активность GUS GUS был также обнаружен в появление боковых корней. Эти результаты показывают, что а. rhizogenes может быть быстро альтернативных инструментом для изучения генов, которые выражаются в корни.
Помимо экономических интересов поколение трансгенных растений имеет свою собственную значимость в исследованиях продемонстрировать конечной функции генов и лучше понять физиологии растений и развития. Наиболее широко используемый метод для растений ДНК вставки Agrobacterium-опосредованной трансформации. Agrobacterium tumefaciens способен генерировать Корона галлов в инфицированных тканях многих видов растений под действием его опухоль заставить плазмида (Ti). Плазмида содержит область T-ДНК с набором генов, которые будут интегрированы в генома растений и побудить ткани дифференцировке1,2. Обмен этих генов в T-ДНК, трансген позволила поколения изменения конкретных растений, избегая Фенотипическая воздействию3. Для облегчения трансген, клонирование в T-ДНК, регионе T-ДНК был вырезан в независимой плазмида, называемый двоичной плазмида, а остальные гены плазмида Ti были (генов вирулентности, которые позволяют механизмы передачи и вставки T-ДНК) помещены в вспомогательный плазмиды. Для исследования в области биотехнологии растений, преобразование A. tumefaciens имеет ряд преимуществ: она не нужны дорогие устройства, способен генерировать как завод стабильного и переходных преобразований, так и небольшого числа генов, копии интегрированы в хромосома4. Однако для большинства растений, но не арабидопсиса, поколение стабильной трансформантов требует регенерации растений из одного или нескольких клеток с помощью экзогенных фитогормонов, делая этот процесс трудоемкий и требует много времени. A. rhizogenes также возможность изменения генома растений, производства волосатые корни или придаточных корней на сайтах инфекции из-за экспрессию генов рол ( локусовкорень), закодированы в плазмиду вызывая корень (Ri)5. Хотя менее изучены чем A. tumefaciens, а. rhizogenes также используется для получения трансгенных корни. В этом случае, а rhizogenes содержит оригинальные T-ДНК в Ри плазмиды и двоичные плазмида с второй T-ДНК, перевозящих трансген. Когда сайт инфекции в стеблях или гипокотиля, композитный растений могут быть получены, с новой волосатые трансгенных корнями, переживших побеги дикого типа. В качестве альтернативы волосатые преобразованные корни могут расти автономно в пробирке в СМИ с входными данными источника углерода. Использование A. rhizogenes вместо A. tumefaciens производить трансгенной ткани приобретает актуальность, когда корень является органом-мишенью, потому что завод регенерации не требуется, и следовательно это быстрее и менее дорогостоящим. Предыдущие исследования показали эту методологию, ассигнованных для фенотипические характеристики корневого конкретные гены6,,78,9.
Картофеля (Solanum tuberosum) является четвертым наиболее важных сельскохозяйственных культур в мире согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной Организации Объединенных Наций (ФАО), поскольку клубень имеет питания актуальность для потребления человеком за то, что является хорошим источником витаминов и минералов. По этой причине картофель был помещен в центре внимания сельскохозяйственной биотехнологии и также считается хорошим биологической модели для генетических и развития исследований в10,11. Значительный вклад в понимание молекулярных механизмов базовой suberized тканей через характеристика генов, участвующих в суберин и воск биосинтез12,13,14 трансформации картофеля ,,1516,17, суберин мономера транспорт18 и транскрипции правила19. Суберин feruloyl трансферазы генов, FHT, является одним из этих характеризуется биосинтетических генов; его Даунрегуляция порождает сильное ухудшение Перидерма защиты, которая коррелируется с сильным снижением ferulate эфиры суберин и воски в клубни картофеля14. Одновременно в корни и семена Arabidopsis, нокаут своего предполагаемого orthologue (ASFT/RWP1) также продемонстрировал свою роль в производить алкиловые ferulates в суберин20,21. В картофеля линии репортер transcriptional FHT и антитела FHT показал соответственно что промоутер активность и белка расположены в exodermis, эндодермы, phellogen производные и раненых тканей15.
В этой работе мы подробно протокол с помощью A. rhizogenes для производства трансгенных волосатые корней, которые поддерживаются в дикого типа стрелять, генерации растений композитный картофеля или вырезан самостоятельно выращивать в пробирке. Мы также предоставляем протокол, используя A. tumefaciens для получения полного трансгенные картофель растений. В качестве тематического исследования а. rhizogenes и A. tumefaciens преобразована с же бинарный вектор используются для получения корни с FHT промоутер вождения ГАС репортер экспрессии генов. Результаты сообщили и сравнить.
В картофеля наиболее распространенной системой для получения стабильной полный трансгенных растений использует преобразование Agrobacterium tumefaciens штаммов, которые требуют органогенеза с помощью экзогенных фитогормонов. Хотя у Agrobacterium на основе протоколов имеет потенциал, чтобы …
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Ministerio de Innovación y науки (AGL2009-13745, ИПИ Грант для PB), y Ministerio де Economía развитию и ФЕДЕР финансирования (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) и Жиронского университета (доктор Грант SF, и Грант SING11/1). Авторы благодарны доктором Инге Broer (Институт землепользования, университета г. Росток, Росток, Германия) и доктор Salomé Прат (Centro Nacional де биотехнология, Мадрид, Испания) для обеспечения а. rhizogenes и A. tumefaciens деформации, соответственно и доктор Marçal Солер и д-р Анна Plasencia за помощь и поддержку, полученную в инициировании трансформации экспериментов A. rhizogenes (Университет Тулуза III Поль Сабатье — CNRS, завод лабораторных исследований (LRSV), Castanet Толозан, Франция). Авторы благодарят Сара Гомес (Кафедра де Biologia, UdG, Жирона) за ее ценную помощь в проведении лабораторных работ и забота о растений и Ferran Fontdecaba и Карла Санчес, который помогал с некоторыми из экспериментов, в то время как они делают свои окончательные дипломных проектов.
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
Microscope |
Olympus |
||
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
pHmetre |
Crison |
||
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
Vacuum |
Dinko |
||
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |