Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.
Agrobacterium SP. é um dos métodos mais utilizados para obter plantas transgênicas, pois tem a capacidade de transferir e integrar sua próprias T-DNA no genoma da planta. Aqui, apresentamos dois sistemas de transformação para modificar geneticamente as plantas de batata (Solanum tuberosum). Na transformação da . tumefaciens , folhas são infectadas, as células transformadas são Selecionadodas e uma nova planta completa de transformada é regenerada usando fitohormônios em 18 semanas. Na transformação da . rhizogenes , hastes estão infectados por injetar a bactéria com uma agulha, as novas raízes peludas surgiu transformadas são detectadas usando um marcador fluorescente vermelho e as raízes não-transformadas são removidas. Em 5-6 semanas, a planta resultante é um composto de um tiro de tipo selvagem com raízes peludas transformados totalmente desenvolvidos. Para aumentar a biomassa, as raízes peludas transformadas podem ser extirpadas e self propagadas. Nós aplicamos os dois métodos de transformação Agrobacterium –mediada para obter raízes expressando o gene repórter GUS impulsionado por um promotor do gene biossintética de suberina. O procedimento de coloração GUS é fornecido e permite a localização de célula da indução promotor. Em ambos os métodos, as raízes de batata transformada mostraram GUS coloração na cor endoderme e exoderme e além disso, em raízes de a. rhizogenes transformou a atividade de GUS também foi detectado o surgimento de raízes laterais. Estes resultados sugerem que a. rhizogenes pode ser uma ferramenta rápida alternativa para estudar os genes que são expressos em raízes.
Além de interesse econômico, a geração de plantas transgênicas tem sua própria relevância na pesquisa para demonstrar a função final dos genes e para entender melhor a fisiologia vegetal e desenvolvimento. O mais amplamente utilizado método para inserção de DNA de plantas é Agrobacterium-mediado transformação. Agrobacterium tumefaciens é capaz de gerar coroa galhas em muitas espécies de plantas, o tecido infectado pela ação do seu do plasmídeo indutor de tumor (Ti). O plasmídeo contém uma região de T-DNA com um conjunto de genes que será integrado no genoma da planta e induzir o tecido quê1,2. A troca destes genes dentro do T-DNA pelo transgene permitiu a geração de modificações específicas planta evitando efeitos fenotípicos3. Para facilitar o transgene clonagem no T-ADN, a região de T-DNA tem sido retirada em um plasmídeo independente chamado um plasmídeo de binário, enquanto o resto dos genes do plasmídeo Ti (os genes de virulência que permitem que os mecanismos de transferência e inserção de T-DNA) têm sido colocadas em um plasmídeo ajudante. Para pesquisa de biotecnologia de plantas, transformação pela . tumefaciens tem várias vantagens: não necessita de dispositivos caros, é capaz de gerar tanto transformação planta estável e transitória e baixo número de cópias são integradas de gene a cromossoma4. No entanto, para a maioria das plantas, mas não de Arabidopsis, a geração de transformants estável requer regeneração de plantas de uma única ou algumas células usando fitohormônios exógenos, tornando este processo trabalhoso e demorado. A. rhizogenes também é capaz de modificar o genoma da planta, produzindo raízes peludas ou adventícias raízes dos locais de infecção devido a expressão de genes de rol (raiz loci) codificado na raiz de indução (Ri) do plasmídeo5. Embora menos estudado do que a. tumefaciens, a. rhizogenes também é usado para a obtenção de raízes transgénicas. Neste caso, a a. rhizogenes contém o T-DNA original no plasmídeo Ri e um plasmídeo binário com um segundo T-DNA carregando o transgene. Quando o local de infecção é em hastes ou hipocótilo, uma planta composta pode ser obtida, com novas raízes transgénicas peludas emergentes de rebentos de tipo selvagem. Alternativamente, raízes transformadas peludas podem crescer autonomamente em vitro na mídia com entradas de fonte de carbono. O uso de a. rhizogenes em vez de a. tumefaciens para produzir tecidos transgênicos está ganhando relevância quando a raiz é o órgão-alvo, porque a regeneração da planta não é necessária e, portanto, é mais rápido e menos dispendioso. Estudos anteriores têm demonstrado esta metodologia apropriada para a caracterização fenotípica de raiz genes específicos6,7,8,9.
A batata (Solanum tuberosum) é a quarta mais importante colheita no mundo de acordo com a organização a alimentação e agricultura das Nações Unidas (FAO) desde que o tubérculo tem relevância nutricional para consumo humano, por ser uma boa fonte de vitaminas e minerais. Por esse motivo, a batata foi colocada no centro do atenções da biotecnologia agrícola e também é considerada como um bom modelo biológico para genética e do desenvolvimento de estudos de10,11. Transformação de batata contribuiu significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes tecidos cor através da caracterização de genes envolveram em suberina e cera biossíntese12,13,14 ,15,16,17, suberina monômero transporte18 e transcrição Regulamento19. Gene da suberina feruloyl transferase, FHT, é um destes genes biossintéticos caracterizadas; seu downregulation dá origem a um forte comprometimento da proteção periderme, que está correlacionado com uma forte diminuição em ésteres Ferulato de suberina e ceras em tubérculos de batata14. Concomitantemente, nas raízes e sementes de Arabidopsis, o nocaute do seu putativo orthologue (ASFT/RWP1), também demonstrou seu papel na produção de ferulates de alquila em suberina20,21. Na batata, a linha de repórter transcriptional FHT e o anticorpo FHT mostraram respectivamente que a atividade de promotor e a proteína estão localizados na exoderme, a endoderme, os felogênio-derivados e em tecidos feridos,15.
Neste trabalho, detalhamos um protocolo utilizando a. rhizogenes para produzir transgênicas raízes peludas que são mantidas em uma sessão do tipo selvagem, gerando plantas de batata composto ou extirpado para crescer autonomamente em vitro. Nós também fornecemos o protocolo utilizando a. tumefaciens para obter plantas de batata transgénica completa. Como um estudo de caso, a. rhizogenes e a. tumefaciens transformada com o vetor binário mesmo são usados para obter as raízes com o promotor FHT dirigindo a expressão do gene repórter GUS . Os resultados são relatados e comparados.
Em batata, o sistema mais comum para obter plantas transgênicas completas estáveis usa a transformação por cepas de Agrobacterium tumefaciens que exigem organogênese usando fitohormônios exógenos. Embora os protocolos de Agrobacterium baseado tem potencial para integrar o vetor não-T-DNA sequência25, esta metodologia é ainda o mais fácil e menos caro disponível para transformar plantas de batata. Durante os últimos anos, o interesse na . rhizogenes-transform…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI grant para PB), o Ministerio de Economía y competitividade e FEDER financiamento (36725-AGL2012, AGL2015-67495-C2-1-R) e a Universidade de Girona (bolsa de doutorado para SF e grant SING11/1). Os autores são gratos ao Dr. Inge Broer (Instituto para o uso da terra, Universidade de Rostock, Rostock, Alemanha) e Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Espanha) para fornecer o a. rhizogenes e a cepa da . tumefaciens , respectivamente e Dr. Marçal Soler e Dr. Anna Plasencia para a ajuda e o apoio recebido no início das experiências de transformação a. rhizogenes (Toulouse III Paul Sabatier University — CNRS, laboratório de pesquisa da planta (LRSV), Castanet Tolosan, A França). Os autores agradecer sua valiosa assistência na realização do trabalho de laboratório e cuidar de plantas e Ferran Fontdecaba e Carla Sánchez assistida com alguns dos experimentos enquanto eles estavam fazendo Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) seus projetos de grau final.
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
Microscope |
Olympus |
||
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
pHmetre |
Crison |
||
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
Vacuum |
Dinko |
||
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |