توميفاسينس المتبعة و rhizogenes المتبعة-بوساطة التحول من البطاطا ونشاط المروج الجين صابرين ب Staining غوس
Summary
وهنا، نقدم البروتوكولين الملحقين بتحويل نباتات البطاطا. تحويل tumefaciens المتبعة يؤدي إلى مصنع وراثيا كاملة في حين rhizogenes المتبعة تنتج جذور شعر المعدلة وراثيا في تبادل لإطلاق النار نوع البرية يمكن أن منشور ذاتيا. ثم يمكننا الكشف عن نشاط المروج غوس تلطيخ في جذور محولة.
Abstract
Sp. المتبعة إحدى الطرق الأكثر استخداماً للحصول على النباتات المعدلة وراثيا، كما أن لديها القدرة على نقل وإدماج الخاصة تي-الدنا في الجينوم المصنع. هنا، نحن نقدم اثنين من أنظمة التحويل تعديلها وراثيا نباتات البطاطس (البطاطا). في تحول A. tumefaciens ، مصابون بأوراق ويتم تحديد الخلايا المحولة ويتم إعادة إنشاء محطة جديدة لتحول كاملة باستخدام فيتوهورمونيس في 18 أسبوعا. في رهيزوجينيس (أ) التحول، مصابون ينبع عن طريق حقن البكتيريا بإبرة وجذور شعر تحول ظهرت جديدة يتم الكشف عنها باستخدام علامة نيون أحمر وتتم إزالة جذور عدم تحويلها. في 5-6 أسابيع، المصنع الناتجة مركب من نوع البرية تبادل لإطلاق النار مع جذور شعر تحول نمواً كاملا. يمكن لزيادة الكتلة الأحيائية، اقتطعت جذور شعر محولة والذاتي نشر. ونحن تطبيق كلا التحول الأساليب المتبعة-بوساطة للحصول على جذور التعبير عن الجينات مراسل غوس يقودها أحد المروجين جينات السكروز صابرين. يرد الإجراء المصبوغة غوس ويسمح التعريب خلية التعريفي المروج. في كلتا الطريقتين، أظهرت أن جذور البطاطا تحول غوس تلطيخ في endodermis سوبيريزيد واكسوديرميس، بالإضافة إلى ذلك، في جذور رهيزوجينيس (أ) تحول النشاط غوس اكتشفت أيضا في ظهور الجذور الجانبية. وتوحي هذه النتائج أن رهيزوجينيس أ- يمكن أن تكون أداة سريعة بديلة لدراسة الجينات التي يتم التعبير عنها في جذور.
Introduction
وبصرف النظر عن الفائدة الاقتصادية، جيل النباتات المعدلة وراثيا وقد أهميته الخاصة في البحث لإظهار وظيفة الجينات في نهاية المطاف، وفهم أفضل لفسيولوجيا النبات والتنمية. الأكثر استخداماً الأسلوب لمصنع الإدراج الحمض النووي هو المتبعة-بوساطة التحويل. Tumefaciens المتبعة قادرة على توليد الصفراوات التاج في الأنسجة المصابة من العديد من الأنواع النباتية بفعل بلازميد (Ti) الأورام المسببة لها. بلازميد يحتوي على منطقة تي-الحمض النووي مع مجموعة من الجينات التي ستدمج في جينوم النبات والحث على الأنسجة ديديفيرينتييشن1،2. أتاح تبادل هذه الجينات داخل تي-الحمض النووي بالتحوير توليد تعديلات محددة مصنع تجنب التأثيرات المظهرية3. تيسيرا للتحوير الاستنساخ في تي-الحمض النووي، وقد تم اقتطعت منطقة تي-دنا في بلازميد مستقل يسمى بلازميد ثنائي، بينما الباقون جينات تي بلازميد (الجينات الفوعة التي تسمح لآليات نقل والإدراج تي-دنا) كانت وضع في بلازميد مساعد. لبحوث التكنولوجيا الحيوية النباتية، التحول من A. tumefaciens مزايا عديدة: لا تحتاج إلى أجهزة مكلفة، وقادرة على توليد تحول المصنع مستقرة وعابرة، وانخفاض عدد الجينات التي يتم دمج النسخ كروموسوم4. ومع ذلك، يتطلب توليد ترانسفورمانتس مستقرة لمعظم النباتات، ولكن لا نبات، تجديد المصنع من واحد أو بعض الخلايا باستخدام فيتوهورمونيس الخارجية، مما يجعل هذه العملية شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. ألف-رهيزوجينيس أيضا قادرة على تعديل جينوم النبات، إنتاج جذور شعر أو جذور العارض في مواقع الإصابة بسبب التعبير عن الجينات رول (الجذر المكاني) المشفرة في بلازميد (Ri) الذي يحفز الجذر5. على الرغم من الدراسة أقل من توميفاسينس أ، رهيزوجينيس أ- يستخدم أيضا للحصول على جذور المحورة وراثيا. في هذه الحالة، يتضمن rhizogenes أ الأصلي تي-الحمض النووي بلازميد Ri وبلازميد ثنائي مع ثانية تي-دنا تحمل التحوير. عندما يكون موقع الإصابة في ينبع أو هيبوكوتيلس، يمكن الحصول مصنع مركبة، مع جذور المعدلة وراثيا شعر الجديدة الناشئة من النوع المتوحش يطلق النار. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تنمو جذور تحول شعر مستقلة في المختبر في وسائل الإعلام مع الكربون مصدر المدخلات. استخدام رهيزوجينيس (أ) بدلاً من توميفاسينس (أ) لإنتاج الأنسجة المعدلة وراثيا يكتسب أهمية عند الجذر هو الجهاز المستهدف، لأن تجديد مصنع غير مطلوب ومن ثم أنها أسرع وأقل تكلفة. وقد أثبتت الدراسات السابقة هذه المنهجية المعتمدة لتوصيف المظهرية الجذر جينات محددة6،7،،من89.
البطاطس (البطاطا) هو رابع أهم محصول في العالم وفقا منظمة الأغذية والزراعة “الأمم المتحدة” (الفاو) منذ الدرنة أهميتها الغذائية للاستهلاك البشري لكونها مصدر جيد للفيتامينات والمعادن. ولهذا السبب، تم وضع في دائرة الضوء للتكنولوجيا الحيوية الزراعية البطاطا ويعتبر أيضا كنموذج جيد بيولوجية الجينية والتنموية الدراسات10،11. تحويل البطاطا ساهم مساهمة كبيرة في فهم الآليات الجزيئية الأنسجة سوبيريزيد الكامنة من خلال وصف الجينات المعنية صابرين والشمع الحيوي12،13،14 15، ،،من1617، النقل مونومر صابرين18 والنسخ البند19. صابرين فيرولويل ترانسفيراز الجينات، فهت، واحد من هذه الجينات السكروز تتسم؛ أن downregulation تثير ضعف قوية للحماية من بيريديرم، الذي يرتبط مع انخفاض قوي في اﻻسترات فيرولاتي من صابرين والشموع في البطاطا الدرنات14. في الوقت ذاته، أن الضربة القاضية لما أورثولوجوي المفترضة (أسفت/RWP1) في جذور وبذور نبات، أظهرت أيضا دورها في إنتاج الألكيل فيرولاتيس في سوبيرين،من2021. في البطاطا، الخط النسخي مراسل فهت وجسم فهت أظهرت على التوالي أن نشاط المروج والبروتين تقع في اكسوديرميس، endodermis، فيلوجين-المشتقات والأنسجة جرح15.
في هذا العمل، نحن التفصيل بروتوكول باستخدام رهيزوجينيس (أ) لإنتاج جذور شعر المعدلة وراثيا التي يتم الاحتفاظ بها في تبادل لإطلاق النار نوع البرية أو توليد نباتات البطاطا المركب اقتطعت لتنمو بصورة مستقلة في المختبر. كما أننا نقدم البروتوكول استخدام A. tumefaciens للحصول على نباتات كاملة من البطاطا المعدلة وراثيا. كدراسة حالة، تستخدم rhizogenes ألف و A. tumefaciens تحول مع ناقل ثنائي نفس الحصول على الجذور مع المروج فهت قيادة غوس مراسل الجينات. وأفادت النتائج ومقارنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في البطاطا، يستخدم النظام الأكثر شيوعاً للحصول على النباتات المعدلة وراثيا كاملة مستقرة التحول بسلالات tumefaciens المتبعة التي تتطلب أورجانوجينيسيس باستخدام فيتوهورمونيس الخارجية. على الرغم من أن البروتوكولات المتبعة على أساس لديه القدرة على دمج متجه غير-تي-الحمض النووي التسلسل<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها y Innovación دي وزارة العلوم (AGL2009-13745، منحة الاستثمار في الحوافظ المالية للجريدة الرسمية) ص دي وزارة الاقتصاد كومبيتيتيفيداد و FEDER التمويل (AGL2012 36725، AGL2015-67495-C2-1-R) وجامعة جيرونا (منحة الدكتوراه لسادس، ومنحة SING11/1). الكتاب ممتنون للدكتور إنجي شقيق (معهد “استخدام الأراضي”، جامعة روستوك، روستوك، ألمانيا)، والدكتور سالومي برات (Centro ناسيونال دي الفن التكنولوجيا الحيوية، مدريد، إسبانيا) لتوفير رهيزوجينيس (أ) وسلالة توميفاسينس (أ) ، على التوالي، والدكتور مارسال سولير والدكتورة أنا بلاسينثيا للمساعدة والدعم الذي تتلقاه في الشروع في تجارب التحول رهيزوجينيس ألف (جامعة تولوز الثالث بول ساباتييه-يزار، ومختبر البحوث النباتية (لرسف)، كاستانيت التخصص، فرنسا). يشكر المؤلفون سارة غوميز (خلية دي بيولوجيا، UdG، جيرونا) لمساعدتها القيمة في الاضطلاع بالأعمال المختبرية والعناية بالنباتات، وفونتديكابا فيران وكارلا سانشيز الذي ساعد مع بعض التجارب بينما كانوا يفعلون مشاريعها الدرجة النهائية.
Materials
|
Acetone |
Panreac |
1.310.071.21 |
|
|
Acetosyringone |
Acros |
115540050 |
|
|
Aquarium pump |
Prodac |
MP350 |
|
|
Autoclave |
Ragpa Strelimatic |
||
|
Bacteriological agar |
Lab Conda |
1800 |
|
|
BAP |
Duchefa |
B0904 |
|
|
Beef extract |
Lab Conda |
1700 |
|
|
Plant growing cabinet |
Nuaire |
||
|
Carbenicillin |
Duchefa |
C0109 |
|
|
Cefotaxime sodium |
Duchefa |
C0111 |
|
|
DMSO |
Merck |
1029310161 |
|
|
Ecotron infors |
HT |
29378 |
|
|
Ethanol |
Merck |
1,009,831,011 |
|
|
Falcon tube |
Control tecnica |
CFT011500 |
|
|
Ferricyanate |
Sigma |
101001081 |
|
|
Ferrocyanate |
Sigma |
100979088 |
|
|
Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture |
Apiglass |
ref16 |
|
|
GA3 |
Sigma |
G7645 |
|
|
Gamborg B5 media |
Duchefa |
G0210 |
|
|
Gelrite |
Duchefa |
G1101 |
|
|
Glucosa |
Sigma |
G5767 |
|
|
Kanamycin |
Sigma |
K1377 |
|
|
Leukopor tape |
BSN Leukopor |
BDF47467 |
|
|
Lupe |
Wild-Heerbrugg |
M420 |
|
|
Magnetic shaker |
Agimatic |
7000243 |
|
|
MES hydrate |
Sigma |
M2933-25G |
|
|
MgSO4 |
Panreac |
131404 |
|
|
Microscope |
Olympus |
||
|
Minufugue centrifugue 5415R |
Eppendorf |
||
|
Murashige and Skoog media |
Duchefa |
M0254.0050 |
|
|
Na2HPO4 |
Panreac |
131679 |
|
|
NAA |
Duchefa |
N0903 |
|
|
NaCl |
Panreac |
131659 |
|
|
NaH2PO4 |
Sigma |
58282 |
|
|
NightSea Stereo |
SFA Moonting Adapter |
||
|
Parafilm |
Anorsa |
PRFL-001-001 |
|
|
Peptone |
Lab Conda |
1616 |
|
|
Petri dishes (90 x 14) |
Anorsa |
200200 |
|
|
pHmetre |
Crison |
||
|
Phytotron |
Inkoa |
RFTI-R5485 |
|
|
Plant Agar |
Duchefa |
P1001 |
|
|
Refrigeratot |
Liebherr Medline |
||
|
Rifampicin |
Duchefa |
R0146 |
|
|
Spectinomycin |
Sigma |
59007 |
|
|
Spectrophotometer |
Shimadzu |
||
|
Square plates (120 x 120) |
Deltalab |
200204 |
|
|
Streptomycin |
Sigma |
S6501 |
|
|
Sucrose |
Panreac |
131621 |
|
|
Surgical blades |
Swann-Morton |
201 |
|
|
Surgical needle |
NIPRO |
015/0204 |
|
|
Triptone |
Lab Conda |
1612 |
|
|
Triton |
Serva |
37240 |
|
|
Unimax 1010 shaker |
Heidolph |
||
|
Vacuum |
Dinko |
||
|
x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous) |
Biosynth |
B-7398 |
|
|
Yeast extract |
Lab Conda |
1702.00 |
|
|
Zeatin riboside |
Sigma |
1001042850 |
References
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA’s journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 467-481 (2013).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).
- Ishida, Y., et al. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacteriumtumefaciens. Nature Biotechnology. 14 (6), 745-750 (1996).
- White, F. F., Taylor, B. H., Huffman, G. A., Gordon, M. P., Nester, E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Journal of Bacteriology. 164 (1), 33-44 (1985).
- Dinh, P. T. Y., Brown, C. R., Elling, A. A. RNA Interference of effector gene Mc16D10L confers resistance against Meloidogyne chitwoodi in Arabidopsis and Potato. Phytopathology. 104 (10), 1098-1106 (2014).
- Horn, P., et al. Composite potato plants with transgenic roots on non-transgenic shoots: a model system for studying gene silencing in roots. Plant Cell Reports. 33 (12), 1977-1992 (2014).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2015).
- Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacteriumrhizogenes as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-469 (2014).
- Zhang, W., et al. Development and application of a universal and simplified multiplex RT-PCR assay to detect five potato viruses. Journal of General Plant Pathology. 83 (1), 33-45 (2017).
- Almasia, N. I., et al. Successful production of the potato antimicrobial peptide Snakin-1 in baculovirus-infected insect cells and development of specific antibodies. BMC Biotechnology. 17 (1), 1-11 (2017).
- Serra, O., et al. Silencing of StKCS6 in potato periderm leads to reduced chain lengths of suberin and wax compounds and increased peridermal transpiration. Journal of Experimental Botany. 60 (2), 697-707 (2009).
- Serra, O., et al. CYP86A33-Targeted gene silencing in potato tuber alters suberin composition, distorts suberin lamellae, and impairs the periderm’s water barrier function. Plant Physiology. 149 (2), 1050-1060 (2008).
- Serra, O., et al. A feruloyl transferase involved in the biosynthesis of suberin and suberin-associated wax is required for maturation and sealing properties of potato periderm. The Plant Journal. 62 (2), 277-290 (2010).
- Boher, P., Serra, O., Soler, M., Molinas, M., Figueras, M. The potato suberin feruloyl transferase FHT which accumulates in the phellogen is induced by wounding and regulated by abscisic and salicylic acids. Journal of Experimental Botany. 64 (11), 3225-3236 (2013).
- Serra, O., Chatterjee, S., Figueras, M., Molinas, M., Stark, R. E. Deconstructing a plant macromolecular assembly: chemical architecture, molecular flexibility, and mechanical performance of natural and engineered potato suberins. Biomacromolecules. 15 (3), 799-811 (2014).
- Vulavala, V. K. R., et al. Identification of genes related to skin development in potato. Plant Molecular Biology. 94 (4-5), 481-494 (2017).
- Landgraf, R., et al. The ABC transporter ABCG1 is required for suberin formation in potato tuber periderm. The Plant Cell. 26 (8), 3403-3415 (2014).
- Verdaguer, R., et al. Silencing of the potato StNAC103 gene enhances the accumulation of suberin polyester and associated wax in tuber skin. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5415-5427 (2016).
- Molina, I., Li-Beisson, Y., Beisson, F., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. Identification of an Arabidopsis feruloyl-coenzyme A transferase required for suberin synthesis. Plant Physiology. 151 (3), 1317-1328 (2009).
- Gou, J. Y., Yu, X. -. H., Liu, C. J. A hydroxycinnamoyltransferase responsible for synthesizing suberin aromatics in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18855-18860 (2009).
- Banerjee, A. K., Prat, S., Hannapel, D. J. Efficient production of transgenic potato (S. tuberosum L. ssp. andigena) plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Science. 170 (4), 732-738 (2006).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. a. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
- Schmidt, J. F., Moore, M. D., Pelcher, L. E., Covello, P. S. High efficiency Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation of Saponariavaccaria L. (Caryophyllaceae) using fluorescence selection. Plant Cell Reports. 26 (9), 1547-1554 (2007).
- Petti, C., Wendt, T., Meade, C., Mullins, E. Evidence of genotype dependency within Agrobacteriumtumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthorainfestans-tolerant potato. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 301-306 (2009).
- Gaudin, V., Vrain, T., Jouanin, L. Bacterial genes modifying hormonal balances in plants. Plant Physiology and Biochemistry. 32 (1), 11-29 (1994).
- Nemoto, K., et al. Function of the aux and rol genes of the Ri plasmid in plant cell division in vitro. Plant Signaling &. Behavior. 4 (12), 1145-1147 (2009).
- Visser, R. G. F., et al. Expression and inheritance of inserted markers in binary vector carrying Agrobacteriumrhizogenes-transformed potato (Solanumtuberosum L.). Theoretical and Applied Genetics. 78 (5), 705-714 (1989).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Pati, P. K., Rideau, M., Gantet, P. Hairy root research: recent scenario and exciting prospects. Current Opinion in Plant Biology. 9 (3), 341-346 (2006).
- Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-Müller, J., Xu, J. Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource. Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).
- Ooms, G., Lenton, J. R. T-DNA genes to study plant development: precocious tuberisation and enhanced cytokinins in A. tumefaciens transformed potato. Plant Molecular Biology. 5 (4), 205-212 (1985).
- de Vries-Uijtewaal, E., et al. Fate of introduced genetic markers in transformed root clones and regenerated plants of monohaploid and diploid potato genotypes. TAG. Theoretical and applied genetics. 78 (2), 185-193 (1989).
- Bird, D., et al. Characterization of Arabidopsis ABCG11/WBC11, an ATP binding cassette (ABC) transporter that is required for cuticular lipid secretion. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 52 (3), 485-498 (2007).
- Luo, B., Xue, X. Y., Hu, W. L., Wang, L. J., Chen, X. Y. An ABC transporter gene of Arabidopsis thaliana, AtWBC11, is involved in cuticle development and prevention of organ fusion. Plant and Cell Physiology. 48 (12), 1780-1802 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DESPERADO/AtWBC11 transporter is required for cutin and wax secretion. Plant Physiology. 145 (4), 1345-1360 (2007).
- Panikashvili, D., et al. The Arabidopsis DSO/ABCG11 transporter affects cutin metabolism in reproductive organs and suberin in roots. Molecular Plant. 3 (3), 563-575 (2010).
- Bjelica, A., et al. Fatty acid ω-hydroxylases from Solanum tuberosum. Plant Cell Reports. 35 (12), 2435-2448 (2016).
- Ding, Y., et al. Abscisic acid coordinates nod factor and cytokinin signaling during the regulation of nodulation in Medicago truncatula. The Plant Cell. 20 (10), 2681-2695 (2008).
- Isayenkov, S., Mrosk, C., Stenzel, I., Strack, D., Hause, B. Suppression of allene oxide cyclase in hairy roots of Medicagotruncatula reduces jasmonate levels and the degree of mycorrhization with glomus intraradices 1[w]. Plant Physiology. 139 (3), 1401-1410 (2005).
- Dalton, D. A., et al. Physiological roles of glutathione S-Transferases in soybean root Nodules 1[C][W][OA]. Plant Physiology. 150 (1), 521-530 (2009).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacteriumrhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55 (399), 983-992 (2004).
